1,25-双羟维生素D3对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠自噬的调控作用

发布时间：2017-09-13 20:25

  本文关键词：1,25-双羟维生素D3对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠自噬的调控作用

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【摘要】：目的:多发性硬化不仅是中枢神经系统的自身免疫性疾病,也是一种神经变性疾病,其发病率和地理纬度具有明显相关性,越远离赤道,多发性硬化的发病率越高。本实验选用1,25(OH)2D3作为干预药物,研究其治疗多发性硬化的有效性,不仅研究其对中枢神经系统白质髓鞘的影响,还深入研究对灰质神经元的作用,并进一步探索其潜在的作用机制。方法:将27只周龄在8-10周左右,体重在18-20g左右的C57BL/6雌性小鼠随机分为正常对照组,EAE组,VD3组(即1,25(OH)2D3给药组),各组均为9只。以MOG多肽为抗原免疫后两组小鼠建立EAE动物模型。以250μg人工合成MOG35-55多肽溶到500μl生理盐水中,和等体积含1mg/ml结核菌素的完全福氏佐剂(CFA)混合,加入结核杆菌H37Ra使结核菌素补充至400ng,充分混匀至油包水乳剂,制成完全抗原,双侧背部分4点皮下注射。于免疫后的第0和48h两次给予小鼠腹腔内注射500ng的百日咳毒素,以建立小鼠的EAE模型。免疫当天记为0天。VD3组小鼠自免疫当天起每隔两日腹腔注射0.1ml 1,25(OH)2D3(用洁净蓖麻油稀释至浓度为1ug/ml),空白对照组和EAE组小鼠均同天腹腔注射0.1ml蓖麻油,直至处死。从免疫当天开始,每天早晚(8∶00和16∶00)两次由两位观察者分别对各组小鼠进行神经功能的评分、称重并给予记录。于免疫后第20天,对三组小鼠进行取材。断颈处死小鼠后,对小鼠大脑组织新鲜取材,切分成两部分,前三分之一,后三分之二(此部分以下称为侧脑室旁脑组织),一部分迅速投入液氮进行快速冷冻,后置于一80℃冰箱保存,进行Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达情况;对脊髓腰骶膨大组织新鲜取材后置于4%多聚甲醛保存,部分制成石蜡切片,进行HE、LFB、Nissl染色,观察炎性细胞的浸润、脱髓鞘情况及神经元形态数目变化;剩余部分的侧脑室旁脑组织和腰骶膨大组织则制成冰冻切片,进行免疫荧光法检测,分别单染Neu N观察神经元的变化,双染Neu N和Beclin1,Neu N和LC3,观察神经元自噬水平的变化。数值采用“均数±标准差”表示,EAE发病率应用Fisher's确切概率法,临床评分应用Mann-Whitney U检验。两组间炎性浸润及脱髓鞘对比应用t检验。多组间的计量资料均数比较应用One-Way ANOVA检验,两两比较应用SNK-q检验或Dunnett's检验。P0.05具有统计学意义。结果:1 1,25(OH)2D3有效改善EAE小鼠的临床症状空白对照组(Control组)小鼠均未发病,活动、食欲等方面均正常。EAE组小鼠发病率达100%,自免疫第一天即出现不同幅度的体重下降,之后逐渐出现活动减少、尾巴无力、反应不灵敏和皮毛不光滑等症状。1,25(OH)2D3治疗组(VD3组)小鼠至取材发病率仅为11.1%(P0.01)。通过比较后两组中小鼠每天的神经功能评分的均数发现,自第11天开始,VD3组小鼠的神经功能评分显著地低于EAE组小鼠(第11天,P0.05;之后P0.01)。2 1,25(OH)2D3明显减轻EAE小鼠脊髓炎性细胞的浸润及髓鞘脱失2.1小鼠腰骶膨大组织HE染色示:Control组小鼠未见炎性细胞的浸润及“血管袖套”样情况;处于发病高峰期的EAE组小鼠脊髓组织切片内可见弥漫的炎性细胞浸润,个别的切片内存在“血管袖套”样改变;VD3组小鼠脊髓组织基本未见炎性细胞浸润征象。HE染色病理评分存在统计学差异。2.2小鼠腰骶膨大LFB染色示:Control组小鼠未见明显髓鞘脱失情况;EAE组发病高峰期小鼠脊髓白质内可见成片的髓鞘脱失区域,呈现白色空泡样变;VD3组小鼠脊髓白质内髓鞘基本完整,未见明显脱失区域。LFB染色病理评分存在统计学差异。3 1,25(OH)2D3有效预防EAE小鼠脊髓灰质神经元的脱失3.1小鼠腰骶膨大Nissl染色示:与Control组相比,EAE组小鼠脊髓灰质内Nissl标记的神经元数目显著减少(P0.01),且呈现不同程度的神经元损伤,如明显核皱缩、尼氏体数目减少等现象。而VD3组小鼠脊髓内Nissl标记的神经元数目则较EAE组增多(P0.01)。3.2免疫荧光染色显示:与Control组相比,EAE组小鼠脊髓灰质内Neu N标记的神经元数目明显减少,而VD3组小鼠脊髓内Neu N标记的神经元数目则较EAE组增多。4发病高峰期的EAE小鼠体内自噬水平存在异常,1,25(OH)2D3可调控EAE小鼠的自噬水平4.1免疫印迹示:发病高峰期的EAE小鼠与Control组小鼠相比,Beclin1的表达明显下降,差异显著(P0.05),而VD3组小鼠Beclin1的表达则较EAE组小鼠明显升高(P0.05)。而LC3-II在各组的表达则呈现出相反的趋势,可见发病高峰期的EAE小鼠与Control组小鼠相比,LC3-II的表达明显升高(P0.01),而VD3组小鼠LC3-II的表达则较EAE组小鼠明显降低(P0.05)。增设EAE氯喹干预组,显示发病高峰期的氯喹治疗组小鼠与EAE组小鼠相比,LC3-II的水平未见明显变化。4.2免疫荧光示:在Control组小鼠神经元内可检测到Beclin1呈一定水平的表达,而在发病高峰期的EAE小鼠神经元内Beclin1的表达明显降低,神经元数目有所减少。在VD3组可见Beclin1表达弥漫性增强。在Control组及VD3组小鼠神经元内几乎检测不到LC3的表达,而在发病高峰期的EAE小鼠神经元内LC3表达增强。结论:1自噬参与了多发性硬化的发生。在发病高峰期的EAE小鼠体内存在自噬体降解受阻的现象。2 1,25(OH)2D3不仅可以减轻EAE小鼠白质炎性脱髓鞘现象,还可以改善神经元受损和脱失情况,而1,25(OH)2D3可通过调节神经元自噬水平发挥神经保护作用。综上,本实验证明1,25(OH)2D3及其类似物,或其他神经元自噬调节剂有望成为治疗多发性硬化的新方向。
【关键词】：1 25(OH)2D3 实验性自身免疫性脑脊髓炎 多发性硬化 自噬 神经元变性
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R744.5
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-22
• 结果22-25
• 附图25-29
• 讨论29-32
• 结论32
• 参考文献32-36
• 综述 维生素D、自噬与疾病36-45
• 参考文献40-45
• 致谢45-46
• 个人简历46

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本文编号：845707