PEI-PEG-Angiopep介导胸苷激酶靶向脑胶质瘤的实验研究

发布时间：2017-09-14 05:49

  本文关键词：PEI-PEG-Angiopep介导胸苷激酶靶向脑胶质瘤的实验研究

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【摘要】：基因治疗是治疗神经胶质瘤有效方法之一,胸苷激酶(thymidine kinase,TK)能够将无毒的前体药物更昔洛韦(ganciclovir,GCV)转变为细胞毒性物质更昔洛韦三磷酸(ganciclovir triphosphate,GCV-TP),从而干扰DNA合成,使DNA复制终止细胞死亡。除此之外,GCV/TK还呈现旁观者效应。目前主要以病毒载体和干细胞介导TK表达,但病毒载体存在安全隐患,干细胞有其应用的局限性。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)为非病毒类基因载体,具有优越的基因传递性能,常被用于基因转染,通过在PEI表面引入靶向基团可以实现主动靶向。本研究首先通过慢病毒介导TK表达,发现GCV/TK能够有效抑制HEK293T和胶质瘤SHG44的增殖,呈现出GCV浓度依赖和时间依赖效应。比较细胞增殖抑制率发现,表达TK的HEK293T和SHG44细胞,GCV的IC50分别为53.0μM,和15.49μM,表明胶质瘤细胞对GCV/TK具有更好的敏感性。进一步,将表达TK与未表达TK的SHG44细胞按1:1的比例混合培养,GCV处理后,未表达TK的SHG44也死亡,表明GCV/TK在胶质瘤中有旁观者效应。进一步,体内荷瘤研究表明,GCV/TK能抑制肿瘤的增殖。为了避免病毒载体可能出现的安全隐患,引用了非病毒类基因载体PEI-PEG。结果表明,PEI-PEG能介导TK在U87MG中表达,有效表达的TK使GCV转化为GCV-TP,产生细胞毒性,抑制细胞增殖。为了能够更好的实现脑靶向,在PEI-PEG上键合脑靶向基团Angiopep、引入胶质细胞特异启动子GFAP,这些策略都有效介导TK的表达使GCV转化为GCV-TP,从而抑制肿瘤细胞增殖,这些工作表明PEI-PEG不仅具有良好的基因传输性能,还可以实现组织特异性表达。目前,我们建立了U87MG-Luc脑胶质原位瘤模型,为更好的研究PEI-PEG-Angiopep介导TK实现组织特异性表达,使GCV转化为GCV-TP抑制胶质原位瘤提供了平台。
【关键词】：神经胶质瘤 胸苷激酶 PEI-PEG-Angiopep 胶质原位瘤
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.4
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 1 引言7-14
• 1.1 胶质瘤基因治疗的现状7-8
• 1.2 TK对胶质瘤治疗的现状8-10
• 1.3 血脑屏障是基因治疗的一个难点10-11
• 1.4 纳米材料作为基因载体的优势11-12
• 1.5 脑胶质原位瘤动物模型12
• 1.6 本文研究的目的和意义12-14
• 2 材料和方法14-20
• 2.1 细胞系、菌种、质粒、纳米载体14
• 2.2 主要试剂和抗体14
• 2.3 主要仪器14
• 2.4 细胞培养14-15
• 2.5 构建p3xflag-cmv10TK表达载体15-16
• 2.5.1 引物序列设计15
• 2.5.2 PCR的反应条件15
• 2.5.3 构建p3xflag-cmv10TK克隆15-16
• 2.6 质粒的大量制备16
• 2.7 慢病毒包装和侵染16-17
• 2.7.1 慢病毒的包装16-17
• 2.7.2 慢病毒的侵染17
• 2.8 细胞的转染17
• 2.9 Western Blot17-18
• 2.9.1 蛋白裂解液的制备17
• 2.9.2 细胞蛋白的提取17
• 2.9.3 免疫印迹17-18
• 2.10 体外血脑屏障模型的构建18
• 2.10.1 体外血脑屏障的构建18
• 2.10.2 体外血脑屏障模型的验证18
• 2.11 MTT实验18
• 2.12 建立脑胶质原位瘤动物模型18-19
• 2.12.1 U87MG-Luc细胞的构建18
• 2.12.2 U87MG-Luc裸鼠皮下模型18-19
• 2.12.3 U87MG-Luc裸鼠脑原位瘤模型19
• 2.13 免疫组化染色19-20
• 3 结果与分析20-28
• 3.1 TK慢病毒的包装、侵染以及表达20
• 3.2 GCV/TK抑制HEK293T细胞的增殖20-21
• 3.3 胶质瘤细胞对GCV/TK呈现更好的敏感性21-22
• 3.4 GCV/TK在胶质瘤细胞中存在旁观者效应22-23
• 3.5 慢病毒介导TK在胶质瘤内表达23
• 3.6 PEI-PEG介导TK有效的表达，结合GCV能抑制胶质瘤细胞的增殖23-24
• 3.7 体外血脑屏障模型的构建24-25
• 3.8 PEI-PEG-Angiopep介导TK在胶质瘤细胞的表达25-26
• 3.9 GFAP特异性启动子介导TK组织特异性表达26-27
• 3.10 脑胶质原位瘤动物模型的构建27-28
• 4 讨论28-30
• 5 结论30-31
• 参考文献31-37
• 致谢37

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本文编号：848261