miR-3473b在局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制研究

发布时间：2017-09-14 06:49

  本文关键词：miR-3473b在局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制研究

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【摘要】：目的:研究mi RNA-3473b在脑缺血再灌注损伤中的表达和功能并初步探究潜在的调控机制。方法:体外模型我们利用脂多糖(LPS)和原代皮层神经元缺糖缺氧(OGD)再灌注后的条件上清刺激BV2小胶质细胞以诱导炎症反应,采用q RT-PCR法检测mi R-3473b的表达变化;然后将mi R-3473b antagomir转染至BV2细胞,抑制mi R-3473b后,分别用LPS和原代皮层神经元OGD的上清刺激BV2细胞,分别采用q RT-PCR和Western blot法检测小胶质细胞激活引起炎症因子表达的变化。为了研究mi RNA-3473b发挥作用的靶点,我们将mi RNA-3473b mimic转染至BV2细胞中过表达mi RNA-3473b,采用q RT-PCR和Western blot法检测SOCS3的表达水平;随后,构建包含作用位点的野生型和突变型SOCS3 m RNA 3’UTR luciferase报告系统,采用荧光素酶报告基因的方法验证mi R-3473b的靶点。体内模型我们使用线栓法建立小鼠局灶性大脑中动脉阻塞(transient middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,采用q RT-PCR法检测脑缺血后小鼠白细胞、皮层和纹状体缺血半暗带中mi RNA-3473b的表达变化。采用侧脑室立体定位注射mi R-3473b antagomir抑制mi R-3473b的作用,3天后构建小鼠MCAO模型。我们以2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)染色测定脑梗死体积,并取相关组织以q RT-PCR和Western blot技术检测小胶质细胞激活而引起的炎症介质的基因和蛋白表达的变化。结果:实验结果显示,BV2小胶质细胞在LPS和原代皮层神经元OGD上清的分别刺激后,mi R-3473b的表达显著上升;以mi R-3473b antagomir抑制BV2小胶质细胞mi R-3473b表达水平,可降低LPS或原代神经元OGD上清刺激激活BV2所引起的i NOS、COX-2、TNF-α和IL-6炎症因子的m RNA及蛋白水平的上升。BV2小胶质细胞中过表达mi R-3473b后,SOCS3的m RNA和蛋白表达水平显著降低;Luciferase assay显示,在HEK293细胞中共转染野生型SOCS3和mi R-3473b mimic比共转染种子序列突变型SOCS3和mi R-3473b mimic的荧光表达强度明显降低。另外,在体内试验中,与假手术组相比,小鼠MCAO再灌注后白细胞、皮层和纹状体缺血半暗带中mi R-3473b表达均显著上升;TTC染色结果表明侧脑室立体定位注射mi R-3473b antagomir的小鼠比注射NC antagomir小鼠脑梗死体积明显减小;同时,mi R-3473b antagomir组降低皮层缺血半暗带中炎症因子i NOS、COX-2、TNF-α和IL-6的m RNA和蛋白表达水平。结论:脑缺血再灌注损伤诱导mi R-3473b水平升高,mi R-3473b的诱导表达加剧脑缺血再灌注损伤,其作用机制可能是与通过靶向SOCS3介导炎症反应相关。
【关键词】：miR-3473b 脑缺血 BV2 炎症 SOCS3
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-13
• 第一章 体外实验13-26
• 一、实验材料13-15
• 1.1 实验仪器13
• 1.2 实验试剂13-15
• 二、实验方法15-21
• 2.1 溶液配制15-16
• 2.2 细胞培养16
• 2.3 原代神经元OGD上清的收集16
• 2.4 细胞转染16-17
• 2.5 实时定量PCR17-19
• 2.6 Western Blot19-20
• 2.7 双荧光素酶报告基因的检测20-21
• 2.8 ELISA21
• 三、实验结果21-26
• 1. LPS和神经元条件培养基刺激BV2细胞后miR-3473b表达上升21-22
• 2. 抑制miR-3473b表达下调LPS诱导的小胶质细胞炎性因子的表达22-23
• 3. 抑制miR-3473b表达下调神经元条件培养基诱导的小胶质细胞炎性因子的表达23-24
• 4. miR-3473b下调BV2细胞中SOCS3的表达24
• 5. 双荧光素酶报告基因验证靶基因24-26
• 第二章 体内实验26-36
• 一、实验材料26-28
• 1.1 实验动物26
• 1.2 实验仪器26-27
• 1.3 实验试剂27-28
• 二、实验方法28-31
• 2.1 小鼠MCAO模型28
• 2.2 TTC染色28
• 2.3 实时定量PCR28-29
• 2.4 Western Blot29-30
• 2.5 ELISA30
• 2.6 统计分析30-31
• 三、实验结果31-36
• 1. MCAO小鼠白细胞中mi R-3473b表达上调31
• 2. miR-3473b在MCAO小鼠缺血半暗带组织中表达上调31-32
• 3. 抑制miR-3473b表达对脑缺血再灌注损伤有保护作用32-33
• 4. miR-3473b antagomir显著降低皮层半暗带炎症因子mRNA表达33-34
• 5. miR-3473b antagomir显著降低皮层半暗带炎症因子蛋白的表达34-36
• 讨论36-39
• 结论39-40
• 参考文献40-44
• 综述44-52
• 参考文献48-52
• 已发表文章52-53
• 英文缩写词表53-54
• 致谢54-55

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1 王小玉;miR-3473b在局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制研究[D];苏州大学;2016年

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本文编号：848535