甘草酸二铵对脑缺血再灌注损伤后神经血管单元的保护作用及机制研究

发布时间：2017-09-15 15:17

  本文关键词：甘草酸二铵对脑缺血再灌注损伤后神经血管单元的保护作用及机制研究

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【摘要】：目的近年来缺血性脑血管病的发病率持续升高,脑组织在经受一定时间的缺血期后,通过各种手段和方法恢复血流供应,脑缺血得到改善后,此时的血流再通又易引起脑缺血再灌注损伤,对这一领域的研究成为近年来的热点,脑缺血再灌注损伤机制复杂,治疗方面也几乎没有针对性的治疗手段和药物。本研究的目的在于探究脑缺血再灌注损伤后神经血管单元的破坏机制,以及甘草酸二铵对神经血管单元的保护作用。方法将160只体重250-300g雄性SD大鼠随机分为正常组(A组)、假手术组(B组)、缺血再灌注生理盐水对照组(C组)、缺血再灌注甘草酸二铵治疗组(D组);采用可逆性大脑中动脉线栓法,模拟缺血再灌注过程,建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,假手术组仅给予相同手术操作,不插入栓线,模型组于术后2h拔出栓线。治疗组于术后2h腹腔注射甘草酸二铵治疗,模型对照组、假手术组、正常组分别腹腔注射等量生理盐水,每日给药1次,共3d。于术后3h大鼠麻醉苏醒后及3d后行大鼠神经功能评分;3d后大鼠取材;行脑组织TTC染色测定梗死体积;干湿重法测定脑含水量;HE染色检测大鼠脑皮层神经元数目;尼氏体染色检测大鼠脑皮层神经元内尼氏小体数量;TUNEL法检测大鼠脑皮层细胞凋亡水平;免疫组化法检测大鼠脑皮层细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,Akt)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达,Western blot检测大鼠脑皮层细胞磷酸化Akt(p-Akt)的表达;免疫荧光法检测大鼠脑皮层水通道蛋白4(aquaporins-4,AQP-4)、紧密连接相关occludin蛋白的表达。结果缺血再灌注损伤大鼠模型建立成功;术前所有大鼠行Zea-Longa评分均为0分,术后3h,A、B、C、D组大鼠Zea-Longa评分分别为0分、0.30±0.48分、2.80±0.92分、2.90±1.20分,A、B组比较,差异无统计学意义(P0.05),C、D组与A、B组比较评分升高,差异有统计学意义(P0.05);3天后D组(1.90±0.74)较C组(2.70±0.48)评分低,差异有显著统计学意义(P0.05);3d后,TTC染色估算梗死体积分别为0、0、(42.48±5.81)%、(31.70±6.57)%,A、B组间比较,差异无统计学意义(P0.05),C、D组较A、B组显著升高,C组较D组高,差异均有统计学意义(P0.05);脑组织含水量分别为(63.11±6.83)%、(65.34±7.49)%、(87.51±5.75)%、(72.23±7.21)%,A、B组间比较,差异无统计学意义(P0.05),C、D组较A、B组显著升高,C组较D组高,差异均有统计学意义(P0.05);HE染色神经元数目分别为233.10±32.47、230.30±41.61、60.20±16.25、116.30±21.45,A、B组间比较,差异无统计学意义(P0.05),C、D组较A、B组低,C组较D组低,差异均有统计学意义(P0.05);尼氏小体数量分别为137.20±27.55、138.90±33.89、50.80±11.10、78.80±16.35,A、B组间比较,差异无统计学意义(P0.05),C、D组较A、B组低,C组较D组低,差异均有统计学意义(P0.05);TUNEL染色阳性细胞数分别为8.90±3.81、7.50±3.66、65.40±8.40、44.80±7.69,A、B组间比较,差异无统计学意义(P0.05),C、D组较A、B组高,C组较D组高,差异均有统计学意义(P0.05);Caspase-3阳性细胞数分别为10.20±6.01、11.60±5.99、99.00±14.85、56.00±14.90,A、B组间比较,差异无统计学意义(P0.05),C、D组较A、B组高,C组较D组高,差异均有统计学意义(P0.05);Akt阳性细胞数分别为86.20±11.41、83.30±10.32、16.60±5.36、47.00±7.06,A、B组间比较,差异无统计学意义(P0.05),C、D组较A、B组低,C组较D组低,差异均有统计学意义(P0.05);p-Akt相对表达量分别为0.83±0.08、0.81±0.11、0.30±0.07、0.62±0.07,A、B组间比较,差异无统计学意义(P0.05),C、D组较A、B组低,C组较D组低,差异均有统计学意义(P0.05);AQP-4平均光密度值分别为0.020±0.003、0.019±0.002、0.044±0.004、0.029±0.005,A、B组间比较,差异无统计学意义(P0.05),C、D组较A、B组高,C组较D组高,差异均有统计学意义(P0.05);occludin平均光密度值分别为0.228±0.021、0.216±0.024、0.060±0.013、0.129±0.017,A、B组间比较,差异无统计学意义(P0.05),C、D组较A、B组低,C组较D组低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论本研究成功建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,并发现神经血管单元损伤在缺血再灌注损伤中起了重要作用,即在缺血再灌注损伤后凋亡抑制蛋白Akt表达下降,凋亡相关Caspase-3蛋白表达明显升高,从而导致缺血再灌注脑组织凋亡明显增加;血脑屏障水调节代谢相关蛋白AQP-4表达升高,紧密连接主要组成蛋白occludin表达降低,从而导致血脑屏障破坏。本研究也表明甘草酸二铵可通过增加Akt表达,降低Caspase-3表达水平来减轻缺血再灌注损伤后细胞凋亡水平;通过降低AQP-4表达、增加occludin表达来减轻缺血再灌注损伤后血脑屏障的破坏;从而发挥对大鼠缺血再灌注损伤后神经血管单元的整体保护作用。
【关键词】：脑缺血再灌注损伤 神经血管单元 甘草酸二铵
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 英文缩略表13-14
• 引言14-16
• 第1章 甘草酸二铵对脑缺血再灌注损伤大鼠保护作用及机制实验研究16-48
• 1.1 实验材料16-19
• 1.1.1 实验动物16
• 1.1.2 实验仪器16-17
• 1.1.3 实验试剂17-18
• 1.1.4 主要溶液的配制18-19
• 1.2 实验方法与步骤19-30
• 1.2.1 动物分组与模型制作19-20
• 1.2.2 实验动物给药20
• 1.2.3 实验动物取材20
• 1.2.4 实验动物脑组织固定、脱水、浸蜡、包埋、切片20-21
• 1.2.5 神经功能学评分方法及标准21
• 1.2.6 大鼠脑组织TTC染色21-22
• 1.2.7 大鼠脑组织含水量测定22
• 1.2.8 大鼠脑组织HE染色22-23
• 1.2.9 大鼠脑组织尼氏染色23
• 1.2.10 大鼠脑组织TUNEL染色23-25
• 1.2.11 大鼠皮层神经元Caspase-3、Akt免疫组化染色25-26
• 1.2.12 大鼠皮层神经元p-Akt Western-blot检测26-28
• 1.2.13 大鼠皮层神经元AQP-4、occludin免疫荧光染色28-29
• 1.2.14 图像采集、结果判定29-30
• 1.2.15 实验数据的统计学分析30
• 1.3 实验结果30-39
• 1.3.1 实验动物模型建立30
• 1.3.2 神经功能学评分结果比较30-31
• 1.3.3 梗死体积所占百分比结果31-32
• 1.3.4 大鼠脑组织含水量变化32-33
• 1.3.5 大鼠皮层神经元HE染色结果33-34
• 1.3.6 大鼠皮层神经元尼氏染色结果34
• 1.3.7 大鼠皮层神经元TUNEL染色结果34-35
• 1.3.8 大鼠皮层神经元Caspase-3、Akt免疫组化染色结果35-37
• 1.3.9 大鼠皮层神经元p-Akt Western blot结果37-38
• 1.3.10 大鼠皮层神经元AQP-4、occludin免疫荧光染色结果38-39
• 1.4 讨论39-44
• 1.4.1 缺血再灌注损伤后神经血管单元的破坏39-40
• 1.4.2 甘草酸二铵对缺血再灌注损伤后神经功能影响40
• 1.4.3 甘草酸二铵对缺血再灌注损伤后脑组织水肿的影响40
• 1.4.4 甘草酸二铵对缺血再灌注损伤后神经元存活的影响40-41
• 1.4.5 甘草酸二铵对缺血再灌注损伤后神经凋亡的影响41-42
• 1.4.6 甘草酸二铵对缺血再灌注损伤后Akt、Caspase-3 表达的影响42-43
• 1.4.7 甘草酸二铵对缺血再灌注损伤后occludin、AQP-4 表达的影响43-44
• 1.5 小结44
• 参考文献44-48
• 第2章 综述 神经血管单元与脑缺血再灌注损伤的研究进展48-63
• 2.1 神经血管单元组成概述48-52
• 2.1.1 神经元48-49
• 2.1.2 血脑屏障49
• 2.1.3 神经胶质细胞49-51
• 2.1.4 周细胞51
• 2.1.5 细胞外基质51-52
• 2.2 脑缺血再灌注损伤的神经血管单元损害的机制52-55
• 2.2.1 脑实质损伤53-54
• 2.2.2 血脑屏障损伤54-55
• 2.2.3 其他损伤55
• 2.3 脑缺血再灌注损伤的神经血管单元保护策略55-57
• 2.3.1 抑制活性氧生成56
• 2.3.2 缺血性调节56-57
• 2.3.3 降血脂药物57
• 2.3.4 其他药物57
• 2.4 展望57-58
• 参考文献58-63
• 结论63-64
• 附录 实验图像64-71
• 致谢71-72
• 导师简介72-73
• 作者简介73-74
• 学位论文数据集74

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本文编号：857298