循环中KLF4、MMP9基因在急性高血压脑卒中发生发展中初步作用

发布时间：2017-09-18 18:36

  本文关键词：循环中KLF4、MMP9基因在急性高血压脑卒中发生发展中初步作用

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【摘要】：研究背景在过去十年,脑卒中成为全球死亡和致残重要原因。在中国,每年脑卒中死亡的人数达160万,已经超过心脏病成为了致死的主要原因。脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中,其中缺血性脑卒中发病率高于出血性脑卒中,达到50-70%。众多研究已经证实高血压是脑卒中最重要的独立危险因素。高血压作为脑卒中的重要病因,高血压患者发生脑卒中的风险是非高血压患者的7倍。即使控制了脑卒中其它危险因素：吸烟、饮酒、高血糖、高血脂等,随着血压升高,脑卒中风险也增加,基础收缩压每增高10mmHg,舒张压每升加5mmHg,脑卒中发病危险分别增高30%和40%。但是,不是每个高血压病人会发生脑卒中,除了环境、生活因素外,还有其他潜在的因素导致脑卒中发生。多个研究指出,脑卒中是一种由环境、生活、遗传等多个因素共同作用引起的复杂性疾病。传统的脑血管病高危因素(高血压、血脂、吸烟、饮酒、糖尿病)仅能解释50-60%的病因,提示遗传因素在脑卒中的发生、发展过程中起着重要的作用。首先,基于双胞胎及家族的研究发现：同卵双胞胎的脑卒中发病率比异卵双胞胎高65%。有脑卒中家族史的人群发生缺血性脑卒中的危险度比无家族史的人群高75%。最新证据来自易感基因的meta分析及全基因组分析研究,已经筛选出与脑卒中相关的候选基因：MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase)、ApoE (apolipoprotein E)、PPARy (peroxisome proliferator-activatedreceptor)、PAI-1 (plasminogen Activator Inhibitor 1)、MMPs (matrix metallopeptidases、ACEI (angiotensin converting enzyme inhibitors)等。另外,mRNA (message RNA)携带遗传信息,基因组分析也涉及到相关基因mRNA的检测。mRNA的表达受到遗传、环境、表观遗传学等多重因素的影响,因此检测外周血相关基因mRNA能综合考虑上述多重因素的影响。综上所述,我们猜想相关基因mRNA能否更好的阐述高血压脑血管病的发生发展的过程。高血压与脑卒中关系密切,但是只有约30%的高血压患者发生缺血性脑卒中或出血性脑卒中。既往的相关研究显示：环境、基因等多重因素的差异导致发病率的差异。缺血性脑卒中的易感基因涉及：炎症反应、凝血／纤溶系统、肾素-血管紧张素系统、内皮功能障碍等,然而出血性脑卒中的易感基因涉及：血管损伤和血管发育等。近年来,越来越多的研究指出颈动脉粥样硬化是脑梗死的重要病因,而脑出血最重要的病因是高血压、动脉粥样硬化。因此从动脉粥样硬化、颈动脉不稳定斑块出发,可以解释部分高血压病人脑卒中的易感性。过去我们针对高血压脑出血患者和高血压无心脑血管并发症患者进行了miRNA (MicroRNA)基因芯片筛查,发现hsa-miR-29a-3p下调倍数最大,然后采用1miRNA靶基因分析软件对hsa-miR-29a-3p进行下游基因预测,预测到103个靶基因。通过查阅文献,发现在预测的103个靶基因中,其中KLF4 (Kruppel-like factor 4)与动脉粥样硬化相关,COL1A2参与Ⅰ型胶原蛋白合成,与动脉血管壁的抗压能力、完整性及可塑性有关,影响血管弹性从而引起脑出血,因此我们选取KLF4和COL1A2对高血压脑出血进行下一步研究。另外炎症与动脉粥样硬化密切相关,我们选取炎症基因:MMP9(Matrix metallopeptidase 9)和sCD40L(soluble CD40 ligand),对高血压脑梗死进行下一步研究。KLF4在动脉粥样硬化过程中,KLF4参与到内皮细胞功能障碍、巨噬细胞活化、血管平滑肌细胞的表型转换。KLF4能诱导血管内皮细胞产生一氧化氮合酶、血栓调节蛋白产生,从而起到抗炎、抗血栓作用。敲除KLF4的小鼠,TNF-α诱导的组织因子和黏附分子表达增加。另一方面,促炎因子IFN-γ(interferon-γ)、LPS (lipopolysaccharides)、TNF-α的过表达促进巨噬细胞活化的过程中,KLF4能被诱导表达；而抑制炎症因子TGF-β1 (transforming growth factor beta 1)过表达能抑制巨噬细胞活性,KLF4表达下调,从而起到促进动脉粥样硬化的作用。另外,KLF4是调节血管损伤有关的平滑肌细胞表型的开关。当血管受损时,KLF4上调,抑制平滑肌细胞的标志蛋白表达,促进血管平滑肌细胞由收缩型向合成型转变,其增殖迁移能力增强,参与到动脉粥样硬化过程中。敲除KLF4的小鼠,其斑块中间坏死物质减少、斑块纤维帽增厚,从而增加了斑块的稳定性。COL1A2COL1A2是编码Ⅰ型胶原α2链的基因。血管壁由Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白共同维持动脉血管壁完整性、可塑性以及抗压性。既往研究表明Ⅰ型胶原蛋白在保证颅内血管壁的完整性及可塑性方面发挥更重要的作用。一般情况下,血管壁Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白同时表达,血管壁的弹性通常与这两种胶原蛋白的构成比例有关。通常Ⅰ型胶原蛋白所占比例越高,血管壁的弹性越低,进而引起血管破裂发生脑出血。MMP9MMP9属于基质金属蛋白酶家族的一员,可由单核巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞在炎症刺激下分泌,在细胞外基质的代谢调节中起重要作用。体外实验证明MMP9可以高效降解Ⅳ型胶原,Ⅳ型胶原是动脉粥样斑块基底膜和纤维帽的重要组成部分。MMP9可能通过破坏了斑块表面的纤维帽的途径,从而增加了斑块的易脆性。Sluijter等人通过组织学分析发现人颈部易损斑块组中MMP9活性和巨噬细胞数量均高于稳定斑块组。血浆MMP9水平也可作为反映颈动脉不稳定斑块的一个指标。Loftus等人对70例行颈动脉内膜切除术患者进行血浆MMP9水平的检测发现,曾有过栓塞患者MMP9明显升高。sCD40LCD40L可由激活的T细胞、血小板、血管平滑肌细胞、内皮细胞、单核巨噬细胞分泌,参与动脉粥样硬化的早期、发展期、斑块破裂期。CD40L主要有2种存在形式：膜结合型CD40L和可溶性CD40L (sCD40L),二者功能相似。sCD40L由膜结合型CD40L经蛋白水解酶分解后脱落形成。血液中测定CD4L就是sCD40L。CD40L能诱导炎性细胞分泌趋化因子、细胞因子、粘附分子等,如血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1、E选择素、白介素-8、肿瘤坏死因子、干扰素等产生,这些因子参与到动脉粥样硬化过程中。sCD40L可促使巨噬细胞、内皮细胞等分泌基质金属蛋白酶,降解基质成分,使斑块纤维帽变薄,斑块易于破裂。鉴于以上理论及实验基础,本研究将包括两部分。第一部分：将对高血压脑卒中患者进行横断面研究,筛选出相关危险因素；第二部分：根据第一部分的结果,我们从炎症基因出发,采用RT-PCR(real time-polymerase chain reaction PCR)法对高血压脑卒中组和对照组的病人全血进行炎症基因相对表达量的检测,通过比较得出有差异性表达的基因。脑卒中危险因素、特异性表达炎症基因可能作为高血压脑卒中高危人群筛选,同时也可以为后续的发病机制提供理论基础,也有助于我们理解高血压脑卒中的发生、发展的病理机制。第1章高血压脑卒中患者相关危险因素分析目的：研究高血压脑出血、高血压脑梗死(主要是动脉硬化相关性脑梗死)的危险因素,筛选出与高血压脑卒中相关的危险因素。方法：2013年1月-2014年12月期间神经内科收治的有高血压病史首次脑卒中患者(137例脑梗死和20例脑出血)和同期心内科收治的高血压无心脑血管疾病的患者(41例)。具体纳入标准：(1)高血压脑出血组：有高血压病史即在安静、清醒的条件下,采用标准的测量方法,至少3次非同日血压值达到或超过收缩压140mmHg和(或)舒张压90mmHg,首次发生脑出血的患者,发病在七天内,排除先天动静脉畸形、动脉瘤、血管炎、外伤等其他原因引起的脑出血患者；(2)高血压脑梗死组：有高血压病史,首次发生脑梗死患者,发病在七天内,排除动脉炎所致的脑梗死(包括感染性和非感染性)、有明确栓子来源的脑栓塞(包括房颤、感染性心内膜炎、空气等)及其他原因引起的脑梗死患者；(3)高血压对照组：有高血压病史,未发生过心脑血管意外。共同的排除标准：肿瘤、严重心肝肾及血液系统疾病、自身免疫性疾病、其他部位的急慢性炎症。对入组的病人进行以下资料的统计：年龄、性别、吸烟、饮酒、糖尿病史、是否服用降压药并将血压严格控制在目标范围、降血脂药、抗血小板药、入院时舒张压、收缩压、血脂(胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)、是否有左室肥大(心脏彩超)、颈动脉斑块形成、是否有颈动脉不稳定斑块(颈动脉彩超)。结果：1.规律服用降压药并将血压严格控制目标范围在高血压脑出血组(P--0.002)和高血压脑梗死组的构成比较低(P--0.015)。2.高血压患者中,合并左室肥大其缺血性脑卒中发病率的风险增加了4.94倍(P=0.02)；合并颈动脉不稳定斑块其缺血性脑卒中风险增加了2.33倍(P=0.017)。3.高血压脑出血和高血压患者对比,有统计学差异的是年龄、入院时舒张压。高血压脑出血患者发病年龄相对较小、舒张压较高,经Logistics回归分析后,年龄和舒张压均与高血压脑出血无关。结论：1.规律服用降压药并将血压严格控制目标范围是高血压脑出血和高血压脑梗死的保护因素。2.动脉粥样硬化、颈动脉不稳定斑块是高血压缺血性脑卒中的重要发病原因。3.左室肥大是高血压缺血性脑卒中的危险因素。第2章动脉粥样硬化炎症基因和COL1A2与高血压脑卒中发生发展的分析目的：探索动脉粥样硬化相关的炎症基因和COL1A2是否与高血压脑卒中相关,进而更好了解炎症基因和COL1A2在高血压脑卒中的发生、发展中可能所起作用。方法：1.2015年1月-2015年12月期间神经内科收治的有高血压病史首次脑卒中患者(45例脑梗死和10例脑出血)和同期心内科收治的高血压无心脑血管疾病的患者(30例)。纳入标准、排除标准、采集资料参考第一部分。2.入组的病人于入院第二天抽取空腹外周血2ml,所有血标本均于2小时以内加入TRIzol试剂,然后进行RNA提取。利用RT-PCR法对MMP9、KLF4、 sCD4L、COL1A2相对表达量进行检测。3.比较高血压脑梗死、高血压脑出血、高血压对照组的MMP9 mRNA、KLF4 mRNA、sCD40L mRNA、COL1A2 mRNA相对表达量,筛选出有差异表达的基因,再探索差异性表达基因与颈动脉不稳定斑块的相关性。结果：1.经过Logistics回归分析后,MMP9 mRNA与高血压脑梗死(OR=1.82,P=0.019)和高血压脑梗死(OR=1.9,P=0.048)相关,KLF4 mRNA仍然与高血压脑梗死相关(OR=1.64,P=0.024)。2.外周血循环KLF4 mRNA和MMP9 mRNA的表达量在颈动脉斑块形成组和无颈动脉斑块形成组差异无统计学意义,外周血循环KLF4 mRNA和MMP9 mRNA的表达量在颈动脉不稳定斑块组和颈动脉稳定斑块组差异无统计学意义。结论：1.差异性表达的KLF4和MMP9可能作为高血压缺血性脑卒中的分子生物标志物：1.可能作为高血压患者中缺血性脑卒中高危人群的筛查,即KLF4和MMP9参与脑梗死的发病机制中,但是由于动脉粥样硬化是一个复杂的过程,仅参考KLF4和MMP9不能很好的反映动脉粥样硬化,也就是KLF4和MMP9不能很好地反映颈动脉斑块形成、颈动脉斑块的不稳定性,KLF4和MMP9可能通过其它途径参与到脑梗死的病理生理过程中,即脑梗死后基因的应激性上调。2. MMP9 mRNA在高血压脑出血患者中表达上调,可能参与到高血压脑出血的发生发展中。3.外周血循环KLF4 mRNA和MMP9 mRNA与颈动脉斑块形成、颈动脉不稳定斑块可能无关。
【关键词】：高血压脑出血 高血压脑梗死 左室肥大 服用降压药 动脉粥样硬化 颈动脉不稳定斑块 高血压脑出血 高血压脑梗死 MMP9 KLF4 COL1A2 sCD40L 颈动脉不稳定斑块
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R544.1;R743.3
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 第1章 绪论19-22
• 第2章 高血压脑卒中相关危险因素分析22-32
• 2.1 材料与方法22-25
• 2.2 实验结果25-27
• 2.3 讨论27-32
• 第3章 动脉粥样硬化炎症基因和COL1A2对高血压脑卒中发生发展的分析32-52
• 3.1 材料与方法34-42
• 3.2 实验结果42-46
• 3.3 讨论46-52
• 第4章 结论52-53
• 参考文献53-59
• 英文缩写词59-60
• 在校期间发表论文情况60-61
• 获奖情况60-61
• 致谢61-63

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