人BMSCs体外复合自体DBM构建组织工程软骨的实验研究

发布时间：2017-10-24 00:34

  本文关键词：人BMSCs体外复合自体DBM构建组织工程软骨的实验研究

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【摘要】：目的：探讨人骨髓间充质干细胞(BMSCs)与自体脱钙松质骨基质(DBM)体外复合,构建组织工程软骨的可行性。 方法：1、术中获取股骨头,利用不离心的全骨髓贴壁培养法分离人BMSCs,进行体外培养扩增,通过形态学观察选用第3代细胞,MTT法绘制生长曲线,流式细胞仪鉴定人BMSCs。2、第3代人BMSCs,利用高密度微团诱导培养法进行成软骨诱导。21天后固定标本,进行病理组织学染色,观察糖胺多糖和Ⅱ型胶原的表达来检测人BMSCs的成软骨诱导能力。3、术中获取股骨头,利用改良Urist法制成DBM,通过电镜观察和降解率等性能测定。将DBM与人BMSCs体外复合后分为2组(n=36)。实验组进行成软骨诱导培养,对照组不进行成软骨诱导。4、细胞支架复合物于第1、2、3个月取材行大体、电镜形态学观察、H-E、阿利新蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色,利用IPP软件行Ⅱ型胶原免疫组化IOD值测定并行统计学分析。 结果：1、不离心全骨髓贴壁培养获取的细胞形态呈长梭状,细胞生长曲线示最佳接种浓度为5×104/ml。流式细胞仪测得细胞表面高表达CD29、CD44和CD105,低表达CD34和CD45。标本诱导后进行阿利新蓝染色示胞质中蓝染,提示有糖胺多糖表达；Ⅱ型胶原免疫细胞化示细胞外基质中可见棕褐色,提示Ⅱ型胶原表达。2、DBM呈立体网状结构,孔径约340μ m,约12周能基本降解完全。电镜观察显示随着DBM降解,细胞处于生长分化的动态过程。3、两组细胞支架复合物病理组织学染色对比,实验组阿利新蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化呈阳性表达。Ⅱ型胶原免疫组化IOD值统计学分析表明,第3个月,实验组与对照组比较有统计学意义,Ⅱ型胶原的表达有差异；实验组内第3个月与前两个月比较均有统计学意义,表明Ⅱ型胶原的表达存在差异。 结论：1、第3代人BMSCs适合作为软骨组织工程的种子细胞。2、人BMSCs与自体DBM体外复合后进行成软骨诱导,具备一定的组织工程软骨特性。全文图45幅,表2个,参考文献73篇。
【关键词】：组织工程 BMSCs DBM 成软骨诱导
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 目录7-9
• ~.略词表9-10
• 前言10-12
• 第一章 人BMSCs的分离培养及鉴定12-30
• 1.1 实验材料12-15
• 1.1.1 实验材料来源与知情同意12
• 1.1.2 主要试剂12-13
• 1.1.3 主要仪器和物品13-14
• 1.1.4 主要液体的配制14-15
• 1.2 实验方法15-20
• 1.2.1 人BMSCs的分离培养15-16
• 1.2.2 人BMSCs的培养及传代16
• 1.2.3 人BMSCs的生长曲线绘制16-17
• 1.2.4 人BMSCs的冻存与复苏17
• 1.2.5 人BMSCs形态学观察17
• 1.2.6 流式细胞仪人BMSCs表型鉴定17-18
• 1.2.7 人BMSCs成软骨诱导分化18-19
• 1.2.8 人BMSCs成软骨诱导分化后染色19-20
• 1.3 结果20-26
• 1.3.1 人BMSCs的分离培养20-21
• 1.3.2 人BMSCs的培养及传代21-22
• 1.3.3 人BMSCs的生长曲线绘制22-23
• 1.3.4 流式细胞仪人BMSCs表型鉴定23-25
• 1.3.5 人BMSCs成软骨诱导分化后染色25-26
• 1.4 讨论26-29
• 1.4.1 种子细胞的选择26
• 1.4.2 细胞培养方法的选择与改良26-27
• 1.4.3 年龄对细胞的影响27
• 1.4.4 种子细胞的鉴定27-28
• 1.4.5 成软骨诱导方法28-29
• 1.5 结论29-30
• 第二章 人BMSCs体外复合DBM构建组织工程软骨30-45
• 2.1 实验材料30-32
• 2.1.1 主要试剂30
• 2.1.2 主要仪器和物品30-31
• 2.1.3 主要液体的配制31-32
• 2.2 实验方法32-35
• 2.2.1 DBM的制作过程32
• 2.2.2 DBM的降解率测定32
• 2.2.3 人BMSCs体外复合DBM制作细胞支架复合物32-33
• 2.2.4 细胞支架复合物的分组33
• 2.2.5 细胞支架复合物电镜扫描33
• 2.2.6 细胞支架复合物组织学染色33-35
• 2.2.7 统计学处理35
• 2.3 结果35-42
• 2.3.1 DBM的大体观察情况35
• 2.3.2 DBM降解率测定35-36
• 2.3.3 细胞支架复合物的扫描电镜观察情况36-37
• 2.3.4 标本病理组织学检测37-41
• 2.3.5 统计学分析结果41-42
• 2.4 讨论42-44
• 2.4.1 人BMSCs体外复合DBM的成软骨诱导基础42-43
• 2.4.2 不同时相点两组成软骨差异性表达的探讨43-44
• 2.5 结论44-45
• 参考文献45-52
• 综述52-61
• 参考文献57-61
• 附录61-63
• 攻读学位期间主要的研究成果目录63-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：1086194