慢病毒介导BMPs基因促进MC3T3-E1细胞成骨作用的实验研究

发布时间：2017-11-28 06:44

  本文关键词：慢病毒介导BMPs基因促进MC3T3-E1细胞成骨作用的实验研究

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【摘要】：背景和目的： 骨再生是治疗骨骼系统相关疾病的关键环节,而大块骨缺损的修复是骨科医生最常遇见的临床问题。组织工程骨有望解决植骨后新骨形成缓慢的问题,近年来,组织工程技术的发展日趋成熟,使得骨缺损的修复成为可能,其中如何促进种子细胞的增殖和成骨分化成为组织工程技术的关键环节和研究热点。理想的组织工程化骨必须具备以下三个要素：种子细胞、细胞因子和支架材料。在促进骨形成的众多调节因子中,骨形成蛋白(BMPs)家族在胚胎发育及骨骼形成中扮演重要的角色。目前发现的BMP家族成员骨诱导活性中研究较多的有BMP、BMP、BMP-6、BMP-7、BMP-9等。目的：针对小鼠BMP-2、BMP-4、 BMP-6、BMP-7、BMP-9基因设计、构建第三代自体失活BMPs慢病毒表达载体,并转染MC3T3-E1细胞,构建成骨诱导因子基因修饰的小鼠类间充质干细胞,观察感染后细胞各基因和蛋白的干扰效率；观察感染后细胞体外成骨分化的影响；评价各成骨诱导因子的成骨分化能力。 方法： 以cDNA文库为模版,应用PCR方法获得BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9,基因的编码序列,经大肠杆菌转化后抽取质粒,构建基因表达质粒载体,酶切鉴定重组体并且经测序进一步确定。然后用pLP/VSVG, pLP2, pLPl质粒与BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9共转染293FT细胞。包装pELNS-BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9后转染小鼠间充质干细胞MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果。茜素红染色检测钙结节,Western-Blot和Real time PCR检测成骨相关基因的表达(Runx2)的表达水平,鉴定各成骨诱导因子的单独转染效能。最后用双基因联合转染(共7组)MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果；应用ELISA检测MC3T3-E1细胞培养上清中BGP和ALP的表达水平；应用Real time PCR检测Runx2mRNA的表达水平；应用Western blot检测BMP2,BMP4, BMP6, BMP7, BMP9蛋白的表达水平,鉴定双基因联合转染的成骨分化效能。 结果： pELNS-BMP2, pELNS-BMP4, pELNS-BMP6, pELNS-BMP7, pELNS-BMP9表达质粒构建成功。重组慢病毒pELNS-BMP2, pELNS-BMP4, pELNS-BMP6, pELNS-BMP7, pELNS-BMP9构建成功,成功转染MC3T3-E1细胞；Runx2表达水平：BMP2BMP4BMP9BMP7BMP6;茜素红染色显示BMP-2钙结节数量最多。双基因(共8组)联合转染MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染成功；Runx2mRNA表达水平：T5T3T1T2T6T4T7; BGP表达：T5T3T4T6T2T1T7; ALP表达：T5T3T1T2T4T6T7;结果显示,T5(BMP2, BMP7)共转染成骨效率最高,Western blot证实BMP2和BMP7联合转染MP3T3-E1细胞后BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9蛋白表达升高。 结论： 第三代慢病毒载体pELNS可将BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9导入小鼠间充质干细胞MC3T3-E1,使其有效的表达；各成骨诱导因子能促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化,BMP2和BMP7双基因联合转染能有效提高成骨转化,这为组织工程骨重建研究提供了重要的理论依据和技术支持。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08

【参考文献】

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本文编号：1233005