人脂肪干细胞复合Matrigel修复裸鼠全层皮肤缺损的实验研究

发布时间：2018-02-08 22:48

本文关键词： 细胞外基质胶 Matrigel 人脂肪源性干细胞创面愈合细胞治疗组织工程　出处：《南方医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:皮肤组织工程学的日益发展,为当下由烧伤、化学损伤等原因引起的皮肤损伤患者带来了福音。在皮肤组织工程技术中,种子细胞和生物相容性支架是其关键所在。而其中,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是种子细胞的研究热点。从人类脂肪组织中分离得到的间充质干细胞即称为人脂肪干细胞(human adipose derived stem cells,hASCs),hASCs 具有易获得、增殖速度快且可跨胚层多向分化等特点,是良好的组织工程种子细胞。研究表明,hASCs可有效的减轻炎症反应,促进肉芽组织沉积、再上皮化、血管重建以及创面收缩,并且可以分化为表皮细胞、血管内皮细胞,继而达到使创面愈合的作用。研究表明,应用单纯干细胞进行移植治疗后,干细胞的存活率较低且存活时间较短,这被认为是当下限制干细胞治疗的主要因素。生物医学组织工程的发展带来的支架材料的改进为干细胞再生治疗提供了新的策略。Matrigel是一种可溶性的基底膜基质,是EHS(Engelbreth-Holm-Swarm,EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的一种凝胶状蛋白质混合物,主要成分包括:层黏连蛋白、胶原Ⅴ、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等,同时含转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子和其它在EHS肉瘤中自然表达的生长因子等,具有非常良好的可注射性以及组织相容性,由于Matrigel的构成类似于许多组织中发现的复杂细胞外环境,因而被细胞生物学家广泛的用作培养细胞的底物,应用于细胞生长、分化以及功能形态研究。因此,我们推测Matrigel可为干细胞提供不被体内微环境损伤的三维支持,是一种理想的可注射生物支架材料。研究目的:本研究通过将hASCs接种于Matrigel中,再进一步将hASCs-Matrigel复合物采用局部注射方法移植至裸鼠背部全层皮肤缺损创面,进而观察其对创面修复的影响,并对其相关机理进行研究,最终实现为临床上皮肤创面尤其是难治性皮肤创面的临床治疗提供新的思路及实验依据。研究方法:第一部分:选择临床上人脂肪抽吸手术所得脂肪组织作为人脂肪干细胞的来源,以酶消化法从人脂肪组织中提取hASCs接种于培养皿,使用HG-DMEM培养基将其培养至第三代。利用倒置显微镜对原代细胞形态进行观察;使用流式细胞仪鉴定细胞表型;加入不同的诱导剂验证干细胞成骨分化及成脂分化的能力。第二部分:将人脂肪干细胞接种于Matrigel中,使用裸鼠建立背部全层皮肤缺损模型,并将实验用裸鼠随机分为3组:设立复合治疗组(hASCs+Matrigel),细胞治疗组(hASCs)和对照组(PBS)。通过创面大体观察来测定各组的愈合曲线进而对各组的愈合情况进行评估;通过活体成像观察来确定hASCs移植后在裸鼠体内的存活情况;各组分别在术后的1d、7d、14d获取标本,进行标本HE染色,免疫组化染色等方法观察和比较各组创面愈合水平;应用qPCR检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-fibroblast growth factor,b-FGF)以及血小板衍生因子(platelet derived growth factor-bb,PDGF-bb)的基因表达,观察hASCs注射至裸鼠皮肤创面的存活与转归。结果:第一部分:hASCs体外培养一周后,大多数细胞呈多边形、梭形或不规则三角形,生长呈旋涡状或束状。细胞传代后增殖速度较快,一周后可达90%融合度,且其免疫表型与脐带血间充质干细胞的表达具有高度一致性。继续培养可见hASCs展现出了良好的成骨、成脂的多向分化能力。成骨诱导在20日可达到90%以上分化;成脂诱导在10日可达到90%以上分化。第二部分:1.创面愈合方面,通过大体皮肤愈合后创面面积绘制愈合曲线并对其进行统计,发现复合治疗组(hASCs+Matrigel)愈合时间最短(与其余两组差异均存在统计学意义),细胞治疗组(hASCs)愈合时间次之(与对照组差异存在统计学意义),而对照组(PBS)愈合时间最长。2.活体成像观察结果显示,复合治疗组(hASCs+Matrigel)细胞荧光信号多于细胞治疗组(hASCs),且复合治疗组移植后的hASCs随时间逐渐汇聚于皮肤创面,而细胞治疗组移植后的hASCs相较于治疗组则更加分散。3.病理学观察HE染色结果显示:各组术后第1d、7d以及14d取材行HE染色,可见术后第14d时复合治疗组(hASCs+Matrigel)创面已经完全愈合,表皮修复情况良好,呈复层上皮排列,同时可见部分炎性细胞浸润。细胞治疗组(hASCs)则仍有部分创面未能愈合,肉芽组织生长良好,已修复部分的表皮修复情况良好,表皮呈复层上皮排列,肉芽组织以及创面表面仍可见较多的炎性细胞浸润。对照组(PBS组)则仍有相当一部分创面尚未能愈合,且已修复部分的表皮修复质量明显不及复合治疗组(hASCs+Matrigel)与细胞治疗组(hASCs),同时可见大量的炎性细胞浸润,在尚未愈合的创口周围可见有瘢痕组织增生。4.各组术后第1d、7d、14d取组织样本行CD31染色观察,可见术后14d复合治疗组(hASCs+Matrigel)创面已经完全愈合,表皮修复情况良好,呈复层上皮排列,创面浅面可见新生血管,深部血管则呈垂直创面的方向生长,且血管密度较大,可见部分炎性细胞浸润。细胞治疗组(hASCs组)则仍有部分创面未能愈合,肉芽组织生长良好,新生血管密度较为丰富,已修复部分的表皮修复情况良好,表皮呈复层上皮排列,肉芽组织以及创面表面仍可见较多的炎性细胞浸润。对照组(PBS组)则有相当一部分创面尚未能愈合,炎性细胞浸润较明显,肉芽组织中新生血管数量较前两组有明显减少;qPCR结果显示术后7d、14d复合治疗组(hASCs+Matrigel)与细胞治疗组(hASCs)的VEGF、EGF、bFGF、FDGF-bb基因表达均有所增高,而对照组则无明显变化,其中复合治疗组增高最为显著,与细胞治疗组(hASCs组)及对照组(PBS)均存在显著性差异,而细胞治疗组(hASCs)同时也与对照组(PBS)存在显著性差异。研究结论:1.我们从临床脂肪抽吸手术中获取人脂肪组织抽吸物,并复制经典的酶消化法从中分离出了 hASCs,通过细胞培养与传代获得第三代hASCs,并参照国际标准对其加以鉴定,从而获得了本实验所需的种子细胞。2.Matrigel复合hASCs可提高细胞在皮肤创面的存活率,并延长细胞的存活时间,从而增强人脂肪干细胞促进创面愈合的作用。3.人脂肪干细胞局部注射治疗裸鼠全层皮肤缺损,可诱导创面局部的微血管再生,而Matrigel所提供的三维支持环境可以增强人脂肪干细胞的旁分泌作用,使促血管生成因子表达增强,使创面区域生成的微血管数量增多。4.人脂肪干细胞移植于裸鼠皮肤缺损区后可分化为表皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞等。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R318.08;R64

【参考文献】