骨髓间充质干细胞与人脱细胞羊膜构建组织工程骨膜的体外成骨研究

发布时间：2018-02-12 16:51

本文关键词： 骨髓间充质干细胞人脱细胞羊膜组织工程骨膜　出处：《福建医科大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景由创伤、骨病或肿瘤术后等引起的骨缺损是临床常见的棘手问题。对骨缺损的传统治疗分为自体骨移植、异体骨移植和异种骨移植。但自体移植存在供区来源有限，且对供区造成损伤，给病人带来一定的痛苦；异体和异种骨移植会引起免疫排斥反应和传播疾病等并发症。根据膜内化骨理论，骨膜成骨在骨折愈合、骨缺损修复有着重要作用。因此，应用组织工程的原理和方法来构建真正意义上的人工骨膜进行骨缺损修复和加快骨折愈合的治疗可作为一种新的思路。然而，要构建的组织工程骨膜必须具有生理骨膜的结构和功能，既要具备成骨作用的种子细胞，又要具备使种子细胞良好附着、增殖、分化的可降解支架材料。因此，选择何种种子细胞和支架材料就显得优为重要。目前，组织工程骨膜取得了一定的进展，国内外许多学者应用成骨细胞及骨髓间充质干细胞体外复合壳聚糖、小肠粘膜下层脱细胞基质，修复兔桡骨缺损取得良好效果。对于壳聚糖等可降解支架材料，仍无法与天然膜性材料相比拟，小肠粘膜下层脱细胞基质虽属于天然结构材料，但大多取材于猪小肠，应用于人的骨缺损修复仍有免疫排斥的风险。现已证实骨髓间充质干细胞能够良好的与人羊膜复合。人羊膜取材来源丰富，具备组织相容性好、含多种胶原等特点，可作为理想的支架材料。另一方面，已经应用骨髓间充质干细胞复合人羊膜脱细胞基质成功修复大鼠全层皮肤损伤，但将二者复合构建仿生骨膜可行性如何尚需进一步验证。目的探讨以人羊膜脱细胞基质为支架材料复合成骨诱导的骨髓间充质干细胞构建组织工程骨膜，以及体外成骨的可行性。为今后构建仿生骨膜动物或人体内成骨提供理论依据。方法本实验首先分离SD大鼠（5-7天乳鼠）双胫骨，用注射器针筒冲洗骨髓，制成单细胞悬液，成功分离并培养出了SD大鼠骨髓间充质干细胞，，并对其进行了组织学鉴定；其次，制备出了人脱细胞羊膜，将人脱细胞羊膜固定后行HE染色，证实细胞成分去除干净；应用扫描电镜观察人脱细胞羊膜的结构特；并且以人脱细胞羊膜为支架，将骨髓间充质干细胞复合该支架进行培养，体外构建组织工程骨膜，对其进行HE染色和电镜扫描显，微镜下观察骨髓间充质干细胞在人脱细胞羊膜上复合、生长、扩增情况,并用MTT检测骨髓间充质干细胞在人脱细胞羊膜（实验组）和无人脱细胞羊膜（对照组）上增殖情况。实验分为两组即骨髓间充质干细胞复合人脱细胞羊膜无诱导剂组（对照组）、骨髓间充质干细胞复合人脱细胞羊膜加诱导剂组（实验组）。结果 1.用物理和化学方法处理后的人脱细胞羊膜表面无细胞残留，空隙多，胶原纤维未受损。2.体外成骨诱导培养条件下，BMSCs可呈多层生长，无接触抑制现象，具有与成骨细胞相似的形态特征和生长特点，茜素红染色钙结节检测阳性；成脂诱导培养条件下，BMSCs无接触抑制现象，逐渐出现空泡，可见脂滴，具有与脂肪细胞相似的形态特征和生长特点，油红染色检测阳性；成软骨诱导培养条件下，BMSCs无接触抑制现象，逐渐出现空泡，具有与软骨细胞相似的形态特征和生长特点，阿利新蓝染色结果阳性。3.在相同条件培养下，实验组（HAAM组）与对照组（无材料组）的两组细胞在不同时间点通过分析两组MTT检测吸光度值，实验结果表明，在各个不同的时间点检测，前4天两组细胞增殖速度无显著性差异（p＞0.05）；第5d，6d两组增殖细胞量，经组间F检验具有显著性差别（p0.05），实验组增殖细胞量比对照组多；第7d，8d两组增殖细胞量，经组间F检验具有显著性差别（p0.01），实验组增殖细胞量比对照组多。4.实验组可见体外细胞与材料复合培养附着佳，大量的细胞外基质分泌，细胞分化良好、增殖活跃；大体观察复合材料见颜色较白，组织变硬，组织学和电镜观察见有大量骨组织形成；对照组中体外复合培养见细胞与材料粘附良好，细胞生长良好，大体观察复合材料见颜色和组织硬度不变。结论 1.人脱细胞羊膜具有良好的细胞相容性，不影响BMSCs的形态，对细胞生长、增殖和功能表达没有抑制作用。2.BMSCs在体外成骨诱导培养后可表达成骨细胞表型，是一种理想的骨组织工程种子细胞。3.人脱细胞羊膜有良好的生物相容性，可以用作骨组织工程的支架材料构建组织工程骨膜。
[Abstract]:Background of the study The bone defect caused by trauma , bone disease or tumor is a common difficult problem . The traditional treatment of bone defects is divided into autogenous bone grafting , allograft bone grafting and xenogeneic bone grafting . At present , the tissue engineering bone membrane has made certain progress , and many scholars at home and abroad apply osteoblasts and bone marrow mesenchymal stem cells in vitro to synthesize chitosan , small intestinal submucosa acellular matrix and repair the rabbit radial defect . Purpose This paper discusses the feasibility of using human amniotic membrane acellular matrix as scaffold material to construct bone membrane of bone marrow mesenchymal stem cells induced by bone marrow mesenchymal stem cells . method The bone marrow mesenchymal stem cells of SD rats were isolated and cultured with syringe barrel , and the cells were successfully isolated and cultured . The cells were cultured in vitro by HE staining and electron microscope scanning . Results The results showed that there was no contact inhibition between the two groups at different time points ( p > 0.05 ) . The proliferation rate of the cells in the experimental group was higher than that in the control group . Conclusion 1 . The human acellular amniotic membrane has good cell compatibility , does not influence the morphology of bone marrow cells , has no inhibition effect on cell growth , proliferation and function expression .

【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08

【共引文献】