组织工程椎间盘纤维环支架构建的实验研究

发布时间：2018-02-19 21:18

本文关键词： 组织工程椎间盘纤维环支架构建脱细胞　出处：《第二军医大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：一、研究目的椎间盘突出症是脊柱的常见病、多发病，是引起颈肩腰背痛的主要原因。目前的治疗手段以缓解症状为主，不能解决椎间盘的生物结构退变等潜在问题。组织工程因能恢复天然组织的功能而成为治疗椎间盘突出的理想方法。尽管大量关于髓核组织工程的研究在实验室阶段已取得了成功，但没有纤维环的椎间盘组织工程难以取得突破。本研究拟对异体新西兰大白兔天然椎间盘纤维环进行脱细胞处理，旨在得到具有天然纤维环细胞外基质的结构、解剖学形态、力学和生物功能的脱细胞支架；同时分离培养兔骨髓间充质干细胞、纤维环细胞，分别对其活性进行测定并与脱细胞纤维环支架复合培养，得出脱细胞纤维环支架没有细胞毒性，支持细胞的生长、繁殖并分泌细胞外基质，从而探索纤维环脱细胞支架作为组织工程椎间盘纤维环支架的可行性。二、研究方法取1月龄新西兰大白兔，麻醉后自髂骨或股骨内侧用骨髓穿刺针抽取3-5ml骨髓，置入培养瓶内，加入培养基以全骨髓培养法分离培养骨髓间充质干细胞。取下脊柱腰段，超净台上剔除椎体骨质及椎间盘外周附着的软组织，PBS液冲洗，去除椎间盘两侧椎骨及终板结构，剔除髓核组织及AF的最外层、最内层，眼科剪将纤维环修剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块，放入培养瓶内进行纤维环细胞原代细胞的培养。3月龄新西兰大白兔过度全麻致死后，取下脊柱腰段，剔除椎体骨质及椎间盘外周附着的软组织，部分去除纤维环两侧终板结构，横径平均约为12mm，矢状径平均约为7mm，高度平均约为3mm。纤维环进行脱细胞处理，制成脱细胞纤维环支架。对脱细胞支架材料行大体、组织学、光镜、电镜观察，并对支架的孔隙率、生物力学参数等进行检测。将支架分别与骨髓间充质干细胞、纤维环细胞复合培养，，将支架植入体内，分析纤维环支架细胞毒性与组织相容性。三、研究结果纤维环细胞呈梭形或多角形，骨髓间充质干细胞为梭形，两者生长融合大70%-80%后均呈现旋涡状生长。MTT法示骨髓间充质干细胞及纤维环细胞均有较强的增殖能力，于第7d左右达到平台期，随后增殖甚微，呈现下降趋势，纤维环细胞较骨髓间充质干细胞下降更为明显。纤维环脱细胞支架为乳白色，中空椭圆状，质地柔软，呈三维多孔结构。HE染色示脱细胞纤维环支架组织内无明显细胞成分残留。冰冻切片Hoechst33258显色提示脱细胞前支架内荧光反应明显，脱细胞支架内未见明显荧光反应，表明纤维环支架脱细胞较彻底，没有细胞残留。扫描电镜及透射电镜示纤维环支架的显微结构，典型的板层结构，胶原纤维束及板层间的弹性纤维结构排列。脱细胞后的胶原结构更加光滑稀松，胶原纤维完整，未见明显改变。支架内孔隙均匀，孔隙相通。孔隙率为42.86±3.41%。生物力学结果脱细胞方法对纤维环前外侧的最大拉力机纤维环后部的弹性模量有一定的影响。纤维环后部最大拉力脱细胞前后最大拉力的差异没有统计学意义，可满足生理需求。体外复合培养证明骨髓间充质干细胞及纤维环细胞在支架上增殖活跃并能产生大量的Ⅰ、Ⅱ型胶原。体内种植8周后，组织学观察显示细胞长入纤维环外层，炎性细胞浸入内外层纤维环之间。四、结论兔椎间盘纤维环支架经脱细胞可有效的去除纤维环支架内部细胞成分，脱细胞彻底，具有良好的孔径、孔隙率及生物力学强度。脱细胞方法对纤维环支架胶原成分和生物力学无明显的影响。纤维环细胞通过负压吸附法渗入纤维环支架内部并生长良好。支架无细胞毒性，具备良好的生物相容性。纤维环经脱细胞处理后可作为组织工程椎间盘纤维环支架材料。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08

【参考文献】