脱细胞猪小肠黏膜下层为支架构建组织工程角膜上皮的可行性研究

发布时间：2018-03-03 22:15

本文选题：小肠黏膜下层　切入点：组织工程　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:角膜上皮的完整性是维持角膜透明及正常视功能的基础,其稳定性依赖于角膜缘干细胞(Limbal Stem Cells,LSCs)的不断增殖分化及向心性移动。眼表疾病(Stevens-Johnson综合征、化学、热、辐射损伤、广泛的微生物感染)和遗传性疾病(先天性无虹膜)可以引发严重或完全的角膜缘干细胞缺乏(Limbal Stem Cell Deficiency,LSCD)或功能障碍,进而导致角膜上皮缺损、进行性角膜结膜化、新生血管化、慢性炎症、角膜浑浊、甚至失明。目前LSCs移植是治疗LSCD及功能障碍的最主要方法,但自体LSCs取材有限,同种异体角膜供体来源严重匮乏及免疫排斥反应等限制了其在临床上的应用。因此,组织工程角膜上皮的构建成为当前的研究热点,理想的支架材料是其构建的关键要素。目的:应用不同浓度的十二烷基磺酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)脱细胞处理猪小肠黏膜下层(Small Intestine Submucosa,SIS),筛选制备脱细胞SIS的最佳浓度时间,并检测其生物相容性及生物安全性,探讨脱细胞SIS用于构建组织工程角膜上皮载体的可行性。方法:配制浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.5%的SDS液体,分别脱细胞处理SIS 15min、30min、1h、2h(n=20),同时在脱细胞过程中观察SIS的大体形态学变化,苏木素-伊红(Hematoxylin And Eosin,HE)和4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色组织学观察脱细胞前后SIS的生物学特性,并对脱细胞后SIS支架行基因组DNA分析(n=5)以初步评价各种浓度时间SDS液体的脱细胞效果;将筛选的脱细胞效果彻底、组织学结构保留完整的标本进行单轴拉伸实验测定其生物力学性能,并以正常猪SIS作对照,筛选出机械力学性能良好的脱细胞标本。应用上述筛选的脱细胞浓度时间处理SIS,并用扫描电镜(Scanning Electron Microscopy,SEM)、透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)观察脱细胞SIS的超微结构;ELISA实验对生长因子含量进行定量分析;CCK-8检测脱细胞SIS浸提液对兔角膜上皮细胞的细胞毒性;脱细胞SIS标本大鼠皮下埋植观察免疫排斥反应;兔角膜基质囊袋内植入脱细胞SIS植片及兔角膜上皮细胞接种在脱细胞SIS植片上的接种实验验证体内及体外的生物相容性;细胞免疫荧光实验检测角膜上皮特异性标记物CK3的表达。结果:脱细胞SIS肉眼观为乳白色、半透明的膜状物、而且具有一定的弹性、韧性和透光性;HE和DAPI染色光学显微镜检查结果显示0.1%及0.2%浓度SDS处理30min时SIS支架材料无细胞、细胞碎片及DNA物质残留,胶原纤维排列规则、有序,组织大体结构保留完整;基因组DNA检测提示0.1%及0.2%浓度SDS处理30min的脱细胞SIS支架细胞及DNA成分去除彻底,脱细胞率可达90%以上;生物力学检测:0.1%SDS处理30min组与正常SIS组比较,极限抗张强度无显著性差异(P0.05),而0.2%SDS处理30min组与正常SIS组及0.1%SDS处理30min组比较均有显著性差异(P0.05)。各组弹性模及断裂伸长率(%)比较无显著性差异(P0.05);SEM和TEM检查脱细胞SIS胶原纤维排列整齐,纤维间孔隙率增加,超微结构基本与正常SIS相似;脱细胞SIS生长因子含量与正常SIS相比无显著性差异(P0.05);脱细胞SIS浸提液对兔角膜上皮细胞生长状态无显著影响;脱细胞SIS大鼠皮下埋植无明显移植术后免疫排斥反应;兔角膜基质囊袋移植脱细胞SIS表现出良好的生物相容性;兔角膜上皮细胞在脱细胞SIS呈复层生长,相邻细胞间存在紧密连接;角膜上皮CK3表达阳性。结论:0.1%SDS脱细胞处理30min是制备脱细胞猪SIS最为理想的浓度时间;脱细胞SIS有一定的机械力学性能、良好的生物相容性及生物安全性,具备构建组织工程角膜上皮支架材料的可行性。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R318.08

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