适用于大样本高分辨三维成像的树脂块连续薄切片研究

发布时间：2018-03-14 21:04

本文选题：高分辨三维成像　切入点：精密加工　出处：《华中科技大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近来兴起的脑神经元网络精细结构的研究，需要能够在哺乳动物全脑范围实现神经突起甚至突触分辨率水平的解剖结构成像的技术。根据这一需求，已发展出许多新的成像方法和成像系统。基于树脂包埋和薄切片的显微成像技术，被认为是目前最可能实现全脑精细神经连接结构获取的方法之一。当这类技术应用于小鼠全脑这种厘米尺寸大样本时，薄切片的加工性能和稳定性对海量地长时间微米分辨率获取神经精细结构数据的质量具有至关重要的影响。然而目前还缺少对连续薄切片尤其是大样本的连续薄切片的系统性的研究。显微光学切片断层成像（Micro-optical Sectioning Tomography, MOST）技术是基于树脂包埋和薄切片的显微成像技术的一个代表，主要致力于研究各种染色的小鼠全脑的高分辨率成像。MOST技术通过对小鼠全脑组织用树脂包埋后进行厚度为0.5-1μm的连续自动薄切片和成像，实现海量数据获取。本文以MOST系统为实验平台，建立用于大样本三维高分辨成像的树脂连续薄切片性能的定量评估和研究方法，并以Spurr树脂为代表的环氧类树脂样本为对象，研究MOST系统微米切片性能。由于大样本薄切片的直接测量实施的难度大，可靠性低，故提出了基于加工表面形貌测量的性能评估的基本思想，并阐述了该方法的总体方案、技术选择、以及评估和优化的标准。表面波纹度、表面粗糙度、切片厚度与切片图像质量和三维重建准确性直接相关。通过表面波纹曲线、三维形貌和台阶高度的获取与测量对这三项基本性能进行研究。MOST系统的具体实验研究表明，MOST系统微米切片Spurr树脂应避免使用会造成振动和表面波纹加强的F300切片速度，并保证样本的邵氏硬度在80以上，由此可在非切片边界处获得Rq低于20nm、Rz低于200nm的高质量表面；通过刀刃滚动角的调节，微米切片的厚度变动范围可以控制在10%以内。大样本的薄切片会经历同一断面分解为多条切片的过程，带来切片条带的横向配准和边界损失问题，并可能直接影响三维图像数据的准确性和完整性。首次提出基于表面锯齿高度的刀刃滚动角测量方法，并以此评估条带的横向配准程度。利用扫描电子显微镜研究条带边界的损失，以边界缺口宽度评价边界损失。MOST系统微米切片Spurr树脂实验说明：加工表面锯齿高度越大，横向条带错位和边界缺口宽度越大；较软的样本更易产生面积较大的边界缺口。通过调整刀刃滚动角将加工表面锯齿高度控制在200-300nm，并尽量采用较硬的样本（推荐1#邵氏硬度，约83.5度），可将横向切片配准偏差控制在20%~30%，边界缺口宽度控制在MOST成像横向分辨率（0.71μm）以下。结合微米台阶高度和锯齿高度的测量，精确计算了MOST微米切片Spurr树脂的实际平均切片厚度，与设定值1μm的偏差不超过3%。大样本薄切片的实施必须在水中进行，，水会使得树脂材料膨胀甚至软化，对切片性能可能会有影响。针对水环境下切片性能进行研究和优化，首次提出了基于表面台阶高度测量的样本表面短时间浸水膨胀程度的定量研究方法，并用于Spurr树脂块的吸湿性膨胀特性研究。根据Spurr树脂吸湿性膨胀特性，应保证同一层断面中各切片条带的浸水时间一致且尽可能短，一般控制在4分钟以内，浸水时间超过8分钟，可能引起加工表面力学性能退化从而造成严重数据损失。利用邵氏硬度测量对Spurr树脂浸水后硬度的变化进行研究，认为25°C的水温和不低于1mm/24h的表面更新速度，基本可以避免水环境降低Spurr树脂切片性能。本文实验研究获得一系列优化切片性能的条件参数，并表明MOST系统运行在可选参数条件下，能实现高精度和长时间稳定的微米切片工作，各项性能指标都优于系统设计的横向和轴向分辨率，可以满足MOST系统获取小鼠鼠脑神经突起水平的全脑解剖数据的需求。综合切片性能和优化条件以及水环境的影响，针对MOST系统长时间数据采集Spurr树脂样本设计合理的切片控制方案，并制定了一套标准规范的MOST系统正式数据采集切片性能监控工艺流程。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R310

【参考文献】