可注射纳米纤维微球联合BMP-2可控缓释技术在牙本质再生组织工程中的应用研究

发布时间：2018-03-18 18:27

本文选题：纳米纤维微球　切入点：人牙乳头干细胞　出处：《第四军医大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：由龋病，牙周病和创伤所引起的牙齿缺损和缺失是目前人类较常见且经常发生的疾病。这些牙齿缺损和缺失往往会影响咀嚼效率，语言功能，面部美观甚至身心健康。现在的修复方法主要是依赖于银汞、树脂、玻璃离子以及牙胶等材料，这些材料往往都难以达到与天然牙齿相似的物理和化学结构，导致有缺陷的临床修复效果。组织工程技术的出现为发展天然牙齿替代物提供了契机。牙齿组织工程技术发展需要三大要素：合适的细胞，生物可降解支架以及优势的生长因子。支架在组织工程再生中有不可或缺的作用。近年来，各种三维多孔支架被用来提供给细胞粘附，增殖，分化以及新组织形成所需的物理化学和生物三维微环境。然而，对于不规则形状的组织或缺损往往需要复杂的设计或合成单层支架来满足形状需求。可注射的细胞载体能通过简单的注射来填充整个缺损位点，使得整个手术过程简单化。近期，我们实验小组成功合成了新型的可注射纳米纤维微球（nanofibrousmicrospheres,NF-MS），期待将其应用于不规则缺损的龋坏而新生牙本质样结构。同时建立乳酸-羟基乙酸（lactic-co-glycolicacid，PLGA）微球包裹的骨形态蛋白2(bonemorphogeneticprotein2，BMP-2)缓释系统，联合可注射NF-MS，验证此体系是否能更好的促进根尖牙乳头干细胞（stemcellfromapicalpapillar，SCAP）向成牙本质样细胞分化，产生类牙本质样结构。目前，NF-MS在牙组织工程领域的应用仍为空白。BMP-2作为生长和分化因子诱导骨组织再生已有大量报道，但其对人SCAP的影响却知之甚少。建立一个有效的BMP-2缓释系统，对于维持BMP-2在体内的活性，防止其降解，维持其有效的生物学浓度十分关键，并具有重要的临床意义。本研究首先通过扫描电镜(scanningelectronmicroscope,SEM)观察，DNA含量测定，实时定量PCR，免疫荧光染色，免疫组化染色以及钙含量测定等方法比较新型的可注射NF-MS与传统的实心微球(solid-interiormicrospheres,SI-MS)在体内体外促进SCAP成牙分化的能力；其次，通过ALP活力测定，钙含量测定，实时定量PCR及免疫组化染色等方法，评估在BMP-2作用下，SCAP在体外单层细胞培养和体外体内NF-MS上的3D培养体系中向成牙本质样细胞分化以及形成牙本质样结构的能力；最后采用SEM,Elisa,VonKossa及免疫组化染色等技术评估BMP-2缓释系统联合NF-MS对SCAP在体内向成牙本质样细胞分化并形成牙本质样结构的影响。我们得出主要结果与结论如下： 1.与SI-MS相比较，SCAP在NF-MS上的形态大多更圆更立体，有更多的基质沉积，增殖速度更快；在成牙诱导3天和7天时，SCAP在NF-MS上的ALP活性显著高于SI-MS；在成牙诱导2周和4周时，ColI、BSP、OCN和DSPP与成牙分化相关的基因表达水平在两种微球上均被上调。在NF-MS上，DSPP和BSP基因在2周和4周时上调水平明显高于SI-MS,而ColI和OCN的表达水平只有在4周时明显高于SI-MS。在4周时DSPP蛋白在NF-MS上的表达最明显，，而2周时DSPP蛋白在SI-MS上几乎无表达。体内标本可见NF-MS组所形成的组织更致密，微球可均匀分布在新生组织中，并被大量的细胞和新生胶原所包裹,部分微球发生退化。而在SI-MS组微球大多聚集在一起，仅有少量的细胞和新生胶原包裹，形成了较少组织。同时NF-MS组显示了更多的钙沉积和DSPP蛋白的阳性表达。由此表明与普通的SI-MS相比，NF-MS在体内和体外更有利于SCAP向成牙方向分化和矿化。 2.与对照组相比，100ng/ml的BMP-2对单层培养的SCAP增殖有一定的影响，却显著促进了SCAP的ALP的活力和矿化能力；在体外SCAP与NF-MS的3D培养体系中，BMP-2在7天和14天时明显提高了SCAP的ALP活性并在4周时显著提高了钙含量。而ColI在2周、OCN在4周和BSP和DSPP在2周和4周时基因的表达水平与对照组相比有显著提高；相应的DSPP蛋白的表达水平在2周和4周时也随之升高；皮下注射结果显示：与对照组相比，BMP-2组所含胶原较多，且有类牙本质样结构产生，矿化结节更明显，DSPP蛋白免疫组化染色显示阳性。由此我们得出结论BMP-2无论在单层培养或3D培养中，均能促进SCAP向成牙方向的分化。 3.尽管可溶性的BMP-2有效促进了SCAP的在体内体外的成牙分化，但由于其易在注射位点流失并在体内快速失活，其潜在的临床应用受到限制，因此我们采用双乳化法成功制成了BMP-2PLGA缓释微球来解决体内重复给药的问题。BMP-2在PLGA微球上的体外缓释方式为多相释药模式，第一天和第二天均爆释16%后，10天到35天期间由快速释放变成缓慢释放模式，平均每天约0.81%，从42天到49天又出现一个快速释放期，总释放率约为22%；皮下注射4周后BMP-2组矿化效果不明显，8周后BMP-2组出现了明显的矿化，且25μgBMP-2组的矿化效果明显高于5μgBMP-2组。组织切片可见大量的骨样牙本质出现在25μgBMP-2组，而5μgBMP-2组骨样牙本质的含量较少；25μg和5μg的BMP-2组均可见DSPP免疫组化染色阳性；体内基因表达分析可见，所有BMP-2组的ColI,BSP,OCN和DSPP基因均被上调，与相应的BSA组有显著的统计学差异。体内钙含量测试结果表明所有BMP-2组的钙含量均高于相应的BSA组，且25μgBMP-2组的钙含量显著高于5μgBMP-2组。由此得出结论，BMP-2在PLGA微球上的缓释具有时间依赖性和浓度依赖性，且我们所建立的缓释体系在体内能有效的促进SCAP向成牙方向分化。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R783.1

【参考文献】