组织工程关节软骨再生修复的在体无创监测方法研究

发布时间：2018-04-02 06:01

本文选题：组织工程　切入点：聚乙烯亚胺(PEI)　出处：《第三军医大学》2013年博士论文

【摘要】：背景关节软骨缺损临床十分常见，但目前的治疗方法，包括保守治疗和关节清理术、自体或异体骨软骨移植、人工关节置换术等均存在明显的缺陷。组织工程技术的发展为再生修复关节软骨缺损提供了新的治疗策略。但是作为组织修复执行者的种子细胞BMSCs移植后的在体迁徙分布、增殖及转归过程，目前尚无安全无创、实时动态的监测手段，因此难以明确外源性种子细胞在关节软骨缺损再生修复中所扮演的角色。而新近的磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）在体示踪磁标记细胞技术为其提供了新思路。超顺磁性氧化铁颗粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticle，SPIO），作为负性磁共振对比剂，用于标记移植细胞后能够在MRI下显著性降低T2加权像的图像信号，明显地区分出外源性的标记细胞与原位组织的未标记细胞，从而间接的反映出外源性细胞的分布及迁移情况。但是对于BMSCs的标记而言，摄取这些SPIO的能力相对较弱导致单位细胞载铁量不足，且其分裂速度较快导致单位细胞的载铁量被迅速稀释，使现有的SPIO产品难以满足长期动态MR监测BMSCs的影像对比剂要求，迫切需要一种能够克服上述问题的新型SPIO材料。目的本课题以我关节外科中心既往对组织工程软骨的研究所获得的重要进展为基础，查阅最新的国内外相关文献，进行新型可控降解性SPIO的制备、体外SPIO标记骨髓MSCs适宜方法、磁标记种子细胞生物相容性评价、MR成像在体示踪磁标记种子细胞的技术方法研究，并以绿色荧光蛋白细胞示踪技术为对照，完成其组织工程技术修复关节软骨缺损动物实验应用研究，以期延长MR监测移植种子细胞的时间，为在体示踪组织工程关节软骨种子细胞的分布、迁移及转归提供一种实时、安全、无创、有效的新技术，为组织工程软骨相关产品的临床应用提供即时监测及疗效评定的方法。方法 1．新型可控降解性超顺磁性纳米颗粒的研制根据Sun等人的方法合成SPIO纳米颗粒。采用乳液挥发法对制备出来的晶体Fe3O4核心使用PEI进行表面修饰，制备出新型可控降解性的PEI/SPIO。采用扫描电镜(Scanning Electronic Mieroseopy，SEM)、动态光散射(Dynamichghtscattering，，DLS)检测颗粒大小，通过磁感应强度检测、弛豫率检测鉴定新合成颗粒的超顺磁性和核磁应用特征。 2．新型SPIO磁标记关节软骨组织工程种子细胞可行性研究采用梯度离心法从猪骨髓中分离培养扩增BMSCs，用不同浓度的PEI/SPIO(4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml)标记第三代BMSCs，孵育时间为24h，以未标记BMSCs为对照。透射电镜检查鉴定细胞内的SPIO颗粒，普鲁士染色测定其标记率；原子吸光光谱仪检测细胞内铁含量；胎盼蓝染色检测细胞存活情况；MTT法测定细胞增殖能力；磁标记BMSCs在诱导液中培养3w，鉴别SPIO标记BMSCs的成骨、成软骨、成脂分化能力：分别进行钙结节-茜素红染色、甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化染色、油红-O染色。选择3.0T MR扫描仪自旋回波加强序列（SET2*WI序列）分别对不同浓度SPIO(4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml)标记的BMSCs按5×10~6、1×10~6、5×10~5、1×10~5、5×10~4、1×10~4、5×10~3细胞浓度进行MR成像。 3．SPIO标记的BMSCs修复猪膝关节软骨缺损的在体MRI示踪研究实验动物选择18只贵州小香猪，随机分为3组，A组：缺损处移植SPIO、GFP双标记BMSCs＋II型胶原凝胶复合物(n＝6)；B组：缺损处移植单纯GFP标记的BMSCs＋II型胶原凝胶复合物(n＝6)；C组：缺损处不作任何处理(n＝6)。A组为实验组，B组为阳性对照组，C组为空白对照组。建立膝关节股骨滑车软骨缺损模型，将SPIO和GFP双重标记的BMSCs（A组）或单纯GFP标记的BMSCs（B组）与1ml II型胶原水凝胶混合体外制备组织工程软骨，然后移植到动物模型的软骨损伤区，于术后4w、8w、12w及24w四个时相点应用磁共振扫描，对膝关节软骨缺损区SPIO标记的BMSCs进行监测。24w后处死动物，行普鲁士蓝染色、番红-O染色、天狼猩红染色及GFP观察鉴定SPIO颗粒及对软骨修复效果的影响。结果 1．新型可控降解性超顺磁性纳米颗粒的研制在有机相中热分解乙酰丙酮铁的方法合成Fe304磁性颗粒，扫描电子显微镜及动态光散射检测粒径大小为15nm-20nm，经X射线衍射仪检测并与国际粉末衍射标准联合会出版的PDF标注卡片进行比较，确定为四氧化三铁晶体结构。经聚乙烯亚胺包被后制成粒径大小为79±28nm，饱和磁化率为48emu/g，T2弛豫率为323Fe mM/s，表面正电荷40mv，溶液终浓度为1.3275mg/ml的PEI/SPIO溶液。 2．新型SPIO磁标记关节软骨组织工程种子细胞可行性研究磁标记细胞普鲁士染色显示细胞标记率随标记浓度增加而增加，8μg/ml标记时细胞标记率达到(97.45±3.15）%，与10μg/ml、12μg/ml标记时无统计学差异；透射电镜检查显示致密铁颗粒主要分布于细胞胞浆内；原子吸光光谱仪检测显示细胞内铁随标记浓度增加而增加，至8μg/ml时达到峰值，随着SPIO浓度的继续增加，细胞内铁反而下降；胎盼蓝染色证实8μg/ml以下SPIO浓度标记对BMSCs活性无明显影响；MTT法绘制生长曲线表明8μg/ml以下SPIO浓度标记对BMSCs增殖能力无显著影响；与未标记BMSCs相比，适宜浓度的SPIO标记的BMSCs的成骨分化、成软骨分化及成脂肪分化潜能未受影响。体外3.0TMR扫描结果提示：5×10~6、1×10~6、5×10~5、1×10~5、5×10~4个标记细胞低信号强度表现与未标记细胞相比具有显著性差异(P0.05)；信号强度衰减率（△SI）随细胞浓度增加而增加，具有显著性差异(P0.05)。 3．SPIO标记的BMSCs修复猪膝关节软骨缺损的在体MRI示踪术后4w，A组MRI（SET2*WI序列）显示软骨缺损区域有明显低信号改变，周围的滑膜组织及关节间隙中未见类似低信号区域，B组缺损区域未见信号变化，C组见缺损区域软骨下骨出现信号增高。术后8w，A组MRI显示软骨缺损区域低信号改变仍较为明显，周围的滑膜组织及关节间隙中未发现类似低信号区域。术后12w软骨缺损处低信号改变较4w和8w减弱，但与B组信号仍有显著差异，周围的滑膜组织及关节间隙中偶有发现类似低信号区域，C组软骨下骨信号增高更加明显。术后24w，A组MRI显示软骨缺损区域低信号改变程度明显减弱，低信号范围亦显著缩小，B、C组较12w未见明显信号变化。术后4w、8w、12w与24w软骨缺损修复区SI值两两相比均有显著性差异。大体及组织学分析发现：术后24w，A组及B组：为透明样软骨修复，表面平整，和周围软骨整合紧密、厚度相近，细胞密度稍大，A组缺损区域可见植入物内散在普鲁士蓝染色阳性细胞及大量GFP表达，两者分布基本一致，B组可见GFP阳性细胞，未见普鲁士蓝染色阳性细胞；C组（空白对照组）：为纤维样组织，表面毛糙，细胞外基质排列紊乱。结论 1．成功合成了新型可控降解性的聚乙烯亚胺包覆的SPIO，理化检测结果表明，新材料具有良好的超顺磁性和核磁应用特征(饱和磁感应强度和T2弛豫率)。 2．PEI/SPIO能直接标记BMSCs，适宜浓度（"f8μg/ml）时磁标记对细胞活性、增殖及成骨、成软骨、成脂分化能力无明显影响，标记细胞在3.0TMR SET2*WI序列上能产生特征性的低信号改变，体外MRI示踪PEI/SPIO标记BMSCs方法可行，最低检测阈值为5×104/cm~3。 3．PEI/SPIO标记BMSCs移植至关节软骨缺损区后可以在3.0TMR SET2*WI序列上产生特征性低信号改变至少24w；MRI体内示踪PEI/SPIO标记BMSCs技术可实时、动态监测外源性BMSCs在活体膝关节软骨区域内的分布、迁移情况，为在体示踪组织工程关节软骨种子细胞的在体生物学行为提供一种实时、安全、无创、有效的新技术，为组织工程软骨相关产品的临床应用提供即时监测及疗效评定的方法。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08

【参考文献】