骨髓间充质干细胞来源微泡的生物学特征及其在组织工程中的应用研究

发布时间：2018-04-09 10:35

本文选题：间充质干细胞　切入点：微泡　出处：《华中科技大学》2016年博士论文

【摘要】：第一部分骨髓间充质干细胞来源微泡的生物学特征目的：研究骨髓来源MSC-MV的形态、大小和免疫表型等基本生物学特征以及其内包含的miRNA的表达情况,为今后研究MSC-MV的生物学效应和临床应用潜能奠定基础。方法：培养大鼠骨髓来源MSC并对其进行鉴定：收集MSC条件培养上清,采用梯度离心方法分离提取MSC-MV;扫描电镜及激光共聚焦显微镜观察MSC-MV的形态及大小：通过流式细胞术检测MSC-MV膜表面是否表达MSC特征性表面标志;采用蛋白定量方法比较MSC在应激条件下释放MV的量;miRNA芯片检测MSC-MV内miRNA总体表达水平,通过生物信息学方法了解MSC-MV内miRNA主要参与的生物学过程。结果：我们通过全骨髓贴壁法培养的大鼠骨髓来源MSC表面表达MSC的经典表面标志,并在体外具有成骨、成脂和成软骨分化能力。通过梯度离心方法,我们分离提取了MSC条件培养上清中的MV,扫描电镜和激光共聚焦显微镜检测提示MSC-MV为类球形,直径在100-1000 nm范围之间,并且流式细胞术检测发现MSC-MV表面表达MSC的经典表面标志,说明其能反映母体细胞的膜表面特征。此外,我们还发现MSC在无血清应激条件下释放的MV的量高于正常培养条件下所释放的量,进一步说明细胞在应激条件下释放的MV会增多。最后,我们采用miRNA芯片方法检测MSC-MV内miRNA的表达情况,发现MSC-MV内包含274种已知的大鼠miRNA,并且这些miRNA参与了多种生物学进程的调控,例如转录调控、细胞内信号级联等等。同时,我们通过查阅文献,发现MSC-MV内包含许多miRNA参与调控干细胞分化、血管新生、造血功能、免疫反应等。结论：骨髓来源MSC在体外培养过程中能产生大量MV,这些MSC-MV大小在100-1000 nm之间,表达其母体细胞的特征性标志,并包含多种miRNA,参与调控多种生物学进程。第二部分：骨髓间充质干细胞来源微泡的体外生物学效应目的：骨组织工程应用中,种子细胞在植入体内后常常由于无法及时建立血供易发生凋亡,基于以往文献报道过的其他种属及组织来源MSC-MV的生物学效应,本部分研究拟从血管新生、抗凋亡以及成骨分化三个方面研究大鼠骨髓来源MSC-MV的体外生物学效应。方法：我们以大鼠骨髓来源MSC-MV为研究对象,在体外将MSC-MV与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共同孵育,通过CCK-8检测、划痕实验和matrigel成管实验等方法研究MSC-MV对HUVEC增殖、迁移和成血管能力的影响。此外,我们在体外通过无血清、低氧培养条件模拟种子细胞植入体内后所处的缺血缺氧环境,将MSC-MV与低氧无血清诱导凋亡的MSC共同孵育,通过TUNEL和qRT-PCR方法检测MSC-MV对诱导凋亡的MSC是否具有抗凋亡效应。同时,我们在体外将MSC-MV分别与成骨诱导和未诱导的MSC共同孵育,通过茜素红半定量和qRT-PCR方法检测MSC-MV对MSC自身成骨分化能力的影响。结果：MSC-MV在体外能促进]HUVEC的增殖、迁移和matrigrl成管能力,并且该效应随MSC-MV浓度上升而增强。此外,我们证明低氧无血清培养能诱导MSC凋亡,而MSC-MV不能减少低氧无血清培养状态下的MSC凋亡细胞数,且对MSC凋亡相关基因的表达水平无显著影响。同时,我们还证明MSC-MV不能增强MSC自身的成骨分化能力,并且对MSC成骨相关基因的表达水平无明显影响。结论：大鼠骨髓来源MSC-MV在体外对内皮细胞具有促血管新生效应,对低氧无血清诱导凋亡的MSC无抗凋亡效应,且对MSC自身成骨分化能力无显著影响,为进一步研究MSC-MV在骨组织工程领域的应用潜能奠定基础。第三部分：骨髓间充质干细胞来源微泡在骨组织工程中的应用潜能目的：我们推测MSC-MV能通过促进血管新而提高组织工程骨移植物的骨再生能力。种子细胞、构建方式和生物材料是骨组织工程技术的三个重要因素,我们拟从构建方式和生物材料两方面研究探讨骨髓MSC-MV在骨组织工程应用中的潜能。方法：从构建方式出发,从我们利用藻酸钠凝胶包裹MSC-MV以及成骨诱导后的MSC接种于聚己内酯(PCL)支架材料上,构建了一种细胞+MV+生物材料复合物。从生物材料角度出发,我们利用MSC-MV包被生物材料脱钙骨基质(DBM),制备MV复合生物材料。我们在体外通过相差显微镜、扫描电镜和激光共聚焦显微镜研究细胞+MV+生物材料复合物和MV复合生物材料的生物学特征。并分别将制备好的细胞+MV+物材料复合物和接种了种子细胞的MV复合生物材料以及相应对照组植入裸鼠皮下异位成骨模型中,通过小动物CT、苏木素-伊红染色和CD31免疫组化染色等方法研究MSC-MV在体内是否能促进血管新生及骨组织再生。结果：我们发现,通过藻酸钠凝胶包裹的方式能使种子细胞均匀的分布于细胞+MV+生物材料复合物中,并且我们所制备的MV复合生物材料上,MV能均匀分布于生物材料上且保持膜结构完整。我们进一步将细胞+MV+生物材料复合物及MV复合生物材料植入裸鼠皮下异位成骨模型,结果显示MSC-MV在体内能促进血管新生及骨组织再生。结论：我们首次利用MSC-MV构建了细胞+MV+生物材料复合物,并制备了MSC-MV复合生物材料。我们还通过体内实验证明,以上两种方式能将MSC-MV成功应用于骨组织工程技术,并且MSC-MV在体内能促进骨再生和血管化。我们的研究提示,MSC-MV在骨组织工程领域具有巨大的应用潜能。
[Abstract]:Objective : To study the biological effects of MSC - MV on MSC - MV by gradient centrifugation , and to investigate the biological effects of MSC - MV on MSC - MV . In vitro , MSC - MV was incubated with human umbilical vein endothelial cells ( HUVEC ) to study the effects of MSC - MV on proliferation , migration and angiogenesis in vitro .

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R68;R318.08

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