永生化人肝星状细胞系的建立及其对肝细胞功能与肝祖细胞分化的影响

发布时间：2018-04-12 15:43

  本文选题：肝星状细胞 + 永生化　； 参考：《浙江大学》2013年博士论文

【摘要】：研究背景 各种原因引起的肝衰竭病死率高达70%～80%。以肝细胞为生物活性成分的生物型人工肝(bioartificial liver, BAL)成为肝衰竭治疗研究的热点和发展方向。 基于原代人肝细胞、原代猪肝细胞、C3A肝肿瘤细胞的三种类型肝细胞的BAL临床试验治疗显示,BAL具有很好的疗效和应用前景。但是,肝细胞源的短缺等问题,依然阻碍着BAL的临床应用和发展。 肝脏干细胞可诱导分化为功能成熟的肝细胞,被认为是非常有前景的细胞源。目前,肝脏干细胞在体外诱导分化是受到多种因素影响和调控,分化后的肝细胞尚难达到生物人工肝临床治疗的数量。因此,需要进一步探索肝脏干细胞的规模化培养和诱导分化的新方式和新方法。 肝细胞永生化是解决肝细胞来源困难的重要可行性途径之一。然而,永生化人肝细胞的基因表达和细胞功能,与原代人肝细胞功能存在一定的差异。因此,必须在解决肝细胞数量的同时,需要进一步提高永生化人肝细胞的分化程度和细胞功能。 细胞与细胞间相互作用在保持和促进细胞功能中起着非常重要作用。在各种共培养体系中,肝细胞与肝非实质细胞之间的相互作用为肝细胞生长提供了微环境,有助于肝细胞保持其结构稳定和细胞功能。肝星状细胞是肝脏中非常重要的非实质细胞。然而,原代肝星状细胞存在着分离繁琐,分离成本较高,容易失去生物学特性和功能等问题。 综上所述,我们从以下几个方面进行研究,建立高活性和功能的永生化人肝星状细胞系,探索永生化人肝星状细胞与永生化人肝细胞共培养对肝细胞功能的影响,以及探索永生化人肝星状细胞对肝祖细胞向肝细胞分化的影响。为优化和完善永生化人肝细胞培养的微环境和建立肝祖细胞向肝细胞分化的新方法提供实验依据,将为生物型人工肝提供更高质量的肝细胞奠定基础。 第一部分永生化人肝星状细胞系的建立及其鉴定 目的：建立高活性和功能的永生化人肝星状细胞系,为肝非实质细胞与肝细胞、肝祖细胞共培养研究提供理想的细胞模型。 方法：采用SV40LT重组反转录病毒感染原代人肝星状细胞,获得永生化人肝星状细胞系。采用电镜技术、RT-PCR等分析永生化人肝星状细胞的形态学、生物学特性和功能等。 结果：建立一株永生化人肝星状细胞系,命名为HSC-Li。该细胞系具有典型的肝星状细胞形态学特征；HSC-Li细胞的Ⅰ、Ⅱ型胶原、HGF等mRNA表达为阳性；HSC-Li细胞的a-SMA、Vimentin、GFAP和SV40LT蛋白表达为阳性。HSC-Li细胞分泌VEGF、HGF、IL-6、TGF-betal等多种细胞因子和炎症因子。 结论：建立了一株永生化人肝星状细胞系HSC-Li,该细胞系具有人肝星状细胞的生物学特性和功能；可为肝细胞与肝星状细胞、肝祖细胞与肝星状细胞共培养研究提供理想的细胞模型。 第二部分永生化人肝星状细胞与永生化人肝细胞共培养对肝细胞功能的影响 目的：探索永生化人肝星状细胞与永生化人肝细胞共培养对永生化人肝细胞功能的影响；为优化和完善永生化人肝细胞培养的微环境提供实验依据。 方法：首先采用SV40LT重组反转录病毒感染原代人肝细胞,获得一株永生化人肝细胞系；通过直接接触共培养、间接接触共培养方式进行永生化人肝细胞与永生化人肝星状细胞共培养研究,测定永生化人肝细胞共培养24h、48h、72h后ALB、 CYP3A5、CYP2E1、UGT2b7等基因的表达水平,以及测定CYP1A2活力。 结果：建立了一株永生化人肝细胞系HepLi5,HepLi5细胞的ALB、GS、CYP2E1、 CYP3A5等基因的mRNA表达均为阳性,具有分泌白蛋白等原代人肝细胞的生物学特性和功能。HSC-Li细胞与HepLi5细胞直接接触和间接接触共培养研究结果显示,HepLi5细胞在共培养24h、48h、72h后ALB、CYP3A5、CYP2E1、UGT2b7等基因表达显著增强,以及CYP1A2活力显著增强。与单独培养组相比较,直接接触共培养方式和间接接触共培养方式均显著增强肝细胞基因表达和功能。 结论：建立了一株永生化人肝细胞系HepLi5,HepLi5细胞具有分泌白蛋白等原代人肝细胞的生物学特性和功能。直接接触共培养和间接接触共培养方式均可显著增强HepLi5细胞的基因表达和细胞功能。为优化和完善永生化人肝细胞培养的微环境提供实验依据,将为生物型人工肝提供更高质量的肝细胞奠定基础。 第三部分永生化人肝星状细胞对肝祖细胞向肝细胞分化的影响 目的：探索永生化人肝星状细胞对肝祖细胞BMEL-TAT分化为肝细胞的影响；为建立肝祖细胞向肝细胞分化的新方法提供实验依据。 方法：通过永生化人肝星状细胞与肝祖细胞间接接触共培养方式诱导肝祖细胞分化为肝细胞,检测肝祖细胞BMEL-TAT共培养前、后细胞表型和功能。 结果：HSC-Li星状细胞与肝祖细胞BMEL-TAT间接接触共培养方式可以诱导肝祖细胞分化为功能成熟的肝细胞。以单独培养BMEL-TAT细胞作为对照,与HSC-Li细胞共培养3天后,BMEL-TAT细胞在细胞形态上开始向肝样细胞转变；与HSC-Li细胞共培养7、14、21天后,BMEL-TAT细胞的ALB、CK18、TAT、G6P等基因表达逐渐增强；细胞免疫荧光染色显示：共培养21天后BMEL-TAT细胞的ALB、CK18表达显著增强,CK19、AFP表达下降。共培养21天后BMEL-TAT细胞的X-gal染色、PAS染色和Dil-LDL吸收实验均为阳性,以及CYP1A2活力和尿素合成也显著增强。 结论：建立了肝祖细胞向肝细胞分化的新方法；永生化人肝星状细胞与肝祖细胞间接接触共培养方式可以诱导肝祖细胞BMEL-TAT向肝细胞分化；可为生物型人工肝提供新型、高质量的肝细胞奠定基础。
[Abstract]:Background of the study

The mortality of liver failure caused by various reasons is as high as 70 % 锝，

本文编号：1740372