运用组织工程方法填补马赛克手术遗留空腔的疗效及共培养中骨髓间充质干细胞对软骨细胞的促进作用

发布时间：2018-10-18 16:26

【摘要】：【目的】观察运用组织工程软骨或BMNC(bone marrow mononuclear cell,骨髓单个核细胞)-PLGA(polylactic-co-glycolic acid,聚乳酸-羟基乙酸共聚物)复合物填补马赛克手术(autologous osteochondral mosaicplasty)遗留空腔的修复效果。【方法】(1)实验分组:取18只7~8月龄骨骼成熟的实验用小型猪,共计36例膝关节,随机分为如下四组。①对照组:单纯马赛克手术;②空白支架组:马赛克手术+空腔通过无细胞的PLGA支架进行填补;③工程软骨组:马赛克手术+空腔通过体外构建的组织工程软骨进行填补;④复合物组:马赛克手术+空腔通过体外构建的BMNC-PLGA复合物进行填补。(2)软骨缺损模型的建立与组织工程移植物的构建:在股骨内髁负重区建立直径为6 mm的软骨缺损模型。工程软骨组中,在制作缺损模型的同时获取自体软骨细胞,将扩增的第2代软骨细胞接种于PLGA支架,以构建组织工程软骨。复合物组中,在进行马赛克手术之前,使用选择性细胞滞留技术从骨髓液中浓集BMNCs,并构建BMNC-PLGA复合物。(3)软骨缺损的修复:首先采用马赛克手术对软骨缺损进行基本修复。随后,通过不同方法对马赛克手术遗留的空腔进行填补。①对照组:空腔不做处理;②空白支架组:使用无细胞的PLGA支架填补空腔;③工程软骨组:使用体外构建的组织工程软骨填补空腔;④复合物组:使用体外构建的BMNC-PLGA复合物填补空腔。(4)检测指标:术后6个月,分别处死实验动物,获取修复组织的样本。通过大体观察、组织学评估、MRI(magnetic resonance imaging,磁共振成像)、生物力学测试和GAG(glycosaminoglycan,糖胺多糖)含量测定等方面对软骨缺损的修复效果进行评价。【结果】在大体观察、组织学评估、MRI形态学评估和T2指数的比较中,工程软骨组和复合物组的各项得分均明显高于对照组和空白支架组,差异具有统计学意义(P0.05)。对照组、空白支架组、工程软骨组和复合物组的平均弹性模量分别为26.9 MPa、28.3 MPa、38.1 MPa和36.2 MPa;工程软骨组和复合物组的弹性模量明显高于对照组和空白支架组,差异有统计学意义(P0.05)。工程软骨组和复合物组的GAG含量分别为10.81±0.79 mg/g和9.49±1.26 mg/g,差异有统计学意义(P0.05)。【结论】运用组织工程软骨填补马赛克手术遗留的空腔可以取得理想的修复效果,但费时、昂贵,且须分两次手术完成。运用BMNC-PLGA复合物填补马赛克手术遗留的空腔也可取得较好的修复效果,是一种相对简单、便捷、经济的修复方法。【目的】初步探讨在共培养系统中ACs(articular chondrocytes,关节软骨细胞)与BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cells,骨髓间充质干细胞)之间的相互作用机制。【方法】共培养实验Ⅰ(1)实验分组:①单纯培养的ACs;②单纯培养的BMSCs;③间接接触共培养的ACs;④间接接触共培养的BMSCs;⑤直接接触共培养的ACs和BMSCs的混合细胞;⑥间接接触共培养的ACs和BMSCs的混合细胞。(2)实验流程:将大鼠的ACs与大鼠的BMSCs按2:1的比例分别进行直接接触和间接接触两种方式的共培养,在第21天收集获取上述六组样本。(3)检测指标:采用实时定量RT-PCR(reverse transcript polymerase chain reaction,逆转录聚合酶链式反应)和Western Blot检测SOX9(SRY(sex determining region Y)-box 9,Y染色体性别决定区-HMG盒9)、COL2(TypeⅡCollagen,Ⅱ型胶原)、Aggrecan、COL10(TypeⅩCollagen,Ⅹ型胶原)和COL1(TypeⅠCollagen,Ⅰ型胶原)的表达变化。共培养实验Ⅱ(1)实验分组:①单纯培养的ACs;②单纯培养的GFP(green fluorescent protein,绿色荧光蛋白)-BMSCs;③间接接触共培养的ACs;④间接接触共培养的GFP-BMSCs;⑤直接接触共培养的ACs;⑥直接接触共培养的GFP-BMSCs。(2)实验流程:将大鼠的ACs与转基因大鼠的GFP-BMSCs按2:1的比例分别进行直接接触和间接接触两种方式的共培养。在第21天,通过流式细胞仪分选直接接触共培养的ACs和GFP-BMSCs,并收集上述六组样本。(3)检测指标:采用实时定量RT-PCR和Western Blot检测SOX9、COL2、Aggrecan、COL10和COL1的表达变化。【结果】与单纯培养的ACs和BMSCs的表达量相比,经过间接接触和直接接触两种方式的共培养之后ACs与BMSCs的SOX9、COL2和Aggrecan的m RNA和蛋白表达量均明显上调。经过直接接触共培养之后,ACs和BMSCs混合细胞的SOX9、COL2和Aggrecan的m RNA和蛋白表达量最高,并且明显高于间接接触共培养的ACs和BMSCs混合细胞的表达量。在SOX9、COL2及Aggrecan的m RNA和蛋白表达量方面,直接接触共培养的ACs的表达量明显高于间接接触共培养的ACs的表达量;直接接触共培养的BMSCs的表达量也明显高于间接接触共培养的BMSCs的表达量。在直接接触和间接接触两种共培养方式中,BMSCs的SOX9、COL2和Aggrecan的m RNA和蛋白表达量均远远低于同一共培养系统中ACs的表达量,甚至仍低于单纯培养的ACs的表达量。【结论】1.与ACs对BMSCs的诱导作用相比,BMSCs对ACs的促进和支持对于增强软骨基质形成起着更加重要的作用。2.与可溶性因子的作用相比,直接物理接触在共培养过程中起主导作用,至少是非常重要的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R687;R318.08

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本文编号：2279695