蚕蛹羧甲基壳聚糖的制备与特性及其对大鼠术后肠粘连的预防作用

发布时间：2018-10-22 16:30

【摘要】：本文以缫丝或机打丝棉片后的废蚕蛹(简称缫丝蛹)为原料,利用慢速冷冻-低温解冻的冻融循环脱乙酰技术制备蚕蛹壳聚糖,并经过与氯乙酸的取代反应获得蚕蛹羧甲基壳聚糖。本文详细地研究了这种羧基壳聚糖的物化性能和结构特征,并研究其对成纤维细胞生长的影响以及对大鼠术后肠粘连的预防作用。将缫丝蛹置于80-100°C烘箱内加热烘干,待水分低于5%,机械粉碎成粉末。随后通过正己烷的萃取,得到蛹油和脱脂蛹粉。脱脂蛹粉进一步通过氢氧化钠脱蛋白,盐酸脱盐和双氧水脱色等加工步骤后得到蚕蛹甲壳素。蚕蛹甲壳素在碱性条件下经过-20°C与40°C反复冻融处理之后,得到蚕蛹壳聚糖。这种蚕蛹壳聚糖再通过碱化和氯乙酸取代反应制备了蚕蛹羧甲基壳聚糖。分析结果表明经过上述冻融循环技术制备的蚕蛹壳聚糖,其脱乙酰度在49.87%左右,粘均分子量仅为2.50×10~4。虽然脱乙酰度低,但是其在2%醋酸(HAc)中的溶解度仍然能达到96.73%。采用电位滴定法对蚕蛹羧甲基壳聚糖的取代度进行了分析,结果表明这种羧甲基壳聚糖为N,O-羧甲基壳聚糖,取代度为1.63,属于高取代度羧甲基壳聚糖。本文采用了SEM、XRD、DSC、FTIR和XPS等分析方法,对蚕蛹样品的物理特性进行更全面和详细的研究。SEM的分析证明蚕蛹壳聚糖和羧甲基壳聚糖样品与对照品相比,表面更加不平整且颗粒断裂情况严重。XRD、DSC、FTIR等分析结果表明,这种蚕蛹来源样品的主要分子链结构与对照品相比无实质性差别。但是其结晶度和热分解温度都有所降低。本文利用小鼠L929成纤维细胞在体外探索蚕蛹羧甲基壳聚糖对其增殖的影响。结果表明其能够明显抑制细胞的增殖,并能够降低TGF-β_1和VEGF基因的表达量。体内实验通过磨损造成大鼠盲肠损伤粘连的模型,检测各项生理生化指标及血清中的炎症因子变化,并与现在临床应用的抗粘连产品的作用效果作了比较研究。实验动物采用60只雄性成年SD大鼠(200-250 g/只),随机分为空白对照(模型)组即生理盐水处理组、阳性对照组即术亿宁医用几丁糖凝胶处理组和实验样品组即自制羧甲基壳聚糖处理。SD大鼠造模成功后,在术后2周和3周分别处死动物取血液和盲肠组织进行肠粘连等级及细胞因子等方面的分析与检测。处死实验动物后,暴露腹腔,通过肉眼观察判定肠粘连等级,结果显示阳性对照组和实验组的大鼠术后肠粘连等级的平均值均低于空白对照(模型)组。血常规检测结果显示,实验组和阳性对照组相比较,白细胞数目无显著差异但都明显低于生理盐水处理的空白对照组,说明蚕蛹羧甲基壳聚糖与医用几丁糖凝胶一样具有良好的抗炎症作用。参与肠粘连形成的细胞因子种类非常多,本项研究结果表明蚕蛹羧甲基壳聚糖溶液能明显降低肠粘连大鼠血清中致炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8的表达量,而对抑炎因子IL-4的表达量并无影响。此外,肠粘连组织中羟脯氨酸含量分析表明,阳性对照组和实验组明显降低,充分表明这两组大鼠粘连程度也明显降低。组织病理切片观察结果说明蚕蛹羧甲基壳聚糖溶液能够减少损伤盲肠组织纤维组织的增生以及炎症细胞的浸润,其效用与医用几丁糖凝胶并无显著差异。TGF-β_1免疫组化分析结果表明蚕蛹羧甲基壳聚糖可以降低组织中TGF-β_1的表达,从而减少腹膜粘连的形成。综上所述,本文利用冻融循环的脱乙酰方法制备脱乙酰度较低的蚕蛹壳聚糖,并通过与氯乙酸的取代反应制备了一种新型的蚕蛹羧甲基壳聚糖。体外成纤维细胞培养实验证明这种羧甲基壳聚糖可以抑制细胞的增生,下调细胞中TGF-β_1和VEGF基因的表达量;体内肠粘连实验证明这种羧甲基壳聚糖通过降低机体炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TGF-β_1)的表达量和白细胞的数量,提高血清总抗氧化的能力,从而减少纤维组织增生和机体的炎症反应,最终有效预防术后肠粘连的发生。这些研究结果为蚕蛹高附加值开发与充分利用奠定了良好的基础,并为以后开发更为有效和实用的抗粘连药物或材料提供有效参考。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ314.1;R318.08

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本文编号：2287695