【摘要】：研究目的全髋关节置换术(THA)是一种安全有效的用于治疗严重退化、创伤后及其它髋关节终末期疾病的方法。然而,随着全髋关节置换术向更年轻更普遍的人群中扩展,翻修手术也因此增多。美国THA翻修手术的概率1990年到2002年从万分之0.95增至万分之1.52,THA失败的主要原因是伴有骨溶解的无菌性松动。骨溶解和无菌性松动,是假体周围组织对假体磨损微粒做出的一种反应结果,假体磨损微粒刺激假体周围的各种免疫细胞表达促炎因子和促破骨性细胞因子以及其他物质来提高破骨细胞细胞(Osteroclast,OC)的活性,并且同时抑制成骨细胞(Osteroblast,OB)的成骨活性。扰乱了骨的动态平衡,导致骨溶解的发生,进而导致假体松动。不同材料的髋关节假体对周围组织的刺激程度不同,在假体周围产生的磨屑微粒中,钛微粒是一种常见的成分,直径小于10μm的钛微粒可以活化OC细胞并使OB细胞的增殖受到抑制,诱发关节假体无菌性松动。信号素(Semaphorins)在脊椎动物中普遍存在,其家族共有八大类二十多个成员。越来越多的研究发现该家族多个成员对OC细胞和OB细胞及其相关细胞都发挥着重要的作用。其中信号素7A(Semaphorin 7A,Sema-7A)通过促进破骨细胞增殖和促进成骨细胞凋亡而在骨动态平衡中扮演着重要角色。本研究旨在探讨抑制Sema-7A对钛微粒干预后的OC细胞活化是否有抑制作用,进一步探讨Sema-7A对钛微粒诱导OC细胞分化、增殖、活化干预作用的分子机制,同时探讨Sema-7A对钛微粒诱导OB细胞凋亡的干预作用,揭示其在预防假体周围骨溶解的潜在价值,为治疗假体周围骨溶解提供新的思路。研究方法通过半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)中的Sema-7A、plexin-C1和β1整合素亚单位(β1-integrin)以及成骨细胞标志物:骨涎蛋白(Bone sialoprotein,BSP)、骨钙素(Osteocalcin,OC)和Ⅰ型胶原的信使RNA(m RNA)表达,Western-blot检测MC3T3-E1细胞中磷酸化的ERK-1/2蛋白表达水平,进行划痕实验观察Sema-7A对成骨细胞迁移的影响。通过RT-PCR检测破骨细胞前体细胞(RAW264.7)中的Sema-7A,及其受体plexin-C1和β1整合素亚单位以及破骨细胞标志物核因子κB受体活化因子(Receptor activation of nuclear factor NF-k B,RANK)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的m RNA表达,用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法在荧光显微镜下观察破骨细胞各阶段的表达情况;通过Western-blot检测Sema-7A蛋白的表达和分布。采用实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)及ELISA检测各种炎症因子,包括IL-1β,IL-6及TNF-α的m RNA和蛋白水平的改变情况;通过Western-blot检测破骨细胞的标志蛋白(RANK、MMP-9)以及磷酸化的P38蛋白表达水平变化;采用MTT法检测破骨细胞增殖情况;应用免疫组化观察MMP-9、RANK蛋白表达阳性细胞的百分数;采用TRAP染色观察及定量成熟破骨细胞的数量。采用流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况;Q-PCR检测骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的m RNA表达情况;Western-blot检测骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达情况;茜素红钙结节染色检测成骨细胞的矿化程度。结果在MC3T3-E1成骨细胞的分化期,Sema-7A m RNA呈现双峰表达,Sema-7A可诱导成骨细胞中磷酸化ERK1/2表达增高,并且呈现时间依赖性。细胞划痕实验证明Sema-7A干预组较联合ERK-1/2抑制剂组愈合快,表明Sema-7A通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路促进MC3T3-E1细胞迁移。在破骨细胞分化时,Sema-7A、plexin C1和β1-integrin表达在分化过程开始时是很低的,但在不成熟破骨细胞融合期升高,表明Sema-7A可能参与破骨细胞融合期的调控。钛微粒可上调破骨细胞炎症因子的表达,诱导成熟破骨细胞数量增殖,转染Sema-7Asi RNA后可逆转这一过程,下调炎症因子的表达,成熟破骨细胞数量也相应减少,表明钛微粒诱导破骨细胞分化和增殖等过程与Sema-7A蛋白的表达有关。用SB203580抑制p38 MAPK通路,检测到破骨细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量减少,MMP-9、RANK蛋白水平降低。由此证明,Sema-7A确实通过p38 MAPK信号通路调节破骨细胞的增殖及炎症因子的分泌。另一部分的结果提示钛微粒可以抑制成骨细胞分化、促进成骨细胞凋亡,过表达Sema-7A后可以使凋亡程度加重,而干扰Sema-7A后则使凋亡程度下降。进一步的研究结果显示,Sema-7A过表达时磷酸化ERK1/2表达增高,干扰Sema-7A后则相反,且抑制ERK1/2活性可使成骨细胞表达的骨涎蛋白、骨钙素和I型胶原蛋白减少。通过实验结果推测Sema-7A可能通过ERK1/2 MAPK信号通路增强钛颗粒抑制鼠MC3T3-E1成骨细胞分化的抑制作用。结论一方面,Sema-7A能够促进成骨细胞迁移,增强钛微粒对成骨细胞分化的抑制作用,且与ERK1/2 MAPK信号通路相关。此外,Sema-7A可抑制成骨细胞的矿化,促进其凋亡。另一方面,Sema-7A可能参与了破骨细胞融合期的调控,进一步研究表明Sema-7A具有增强钛微粒促成熟破骨细胞增殖的作用,该过程也与p38 MAPK信号通路相关,通过激活MAPK途径调节破骨细胞的增殖及炎症因子的分泌。我们从细胞实验层面证实干扰Sema-7A部分阻断了钛微粒诱导骨溶解过程的发生,进而为临床上用生物技术靶向治疗磨损微粒诱导的骨溶解问题提供了一条可行的思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R687.4;R318.17
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本文编号：
2336502
