【摘要】：生物膜结构和功能复杂，双层类脂膜(BLMs)作为模拟生物膜模型已被广泛接受。修饰了活性物质的BLMs可作为离子转运的通道，抗原-抗体键合的骨架，氧化还原反应的双极性电极或是能量转化的器件，在研究各类生物分子与膜的相互作用，了解生物膜功能，开发新型生物传感器方面发挥了重要作用。环境雌激素是一类存在于环境中，具有类似生物体内雌激素活性的化学物质。越来越多的证据显示,许多被人类不合理释放于环境中的化学污染物具有雌激素的生物效应。建立准确、灵敏、高效的环境雌激素检测筛查方法对把握环境质量、预防环境雌激素对人类造成的危害具有重要意义，现有环境雌激素的检测筛查技术尚需进一步的补充完善。 本研究针对制约传感器发展的固定化关键技术，以17β-雌二醇，己烯雌酚，双酚A等典型环境雌激素为代表，研究活性物质(水溶性抗体和膜受体)在BLMs上的修饰，分别以雌激素抗体和膜受体(mER)作为功能元件，构建基于BLMs的新型电化学免疫传感器，并初步用于环境雌激素的检测和筛查，主要研究内容包括： 1.固体支撑稳定BLMs体系的构建 (1)成膜液组成和配比的优化：卵磷脂和胆固醇作为成膜液主要成分，研究了不同卵磷脂和胆固醇浓度和配比对BLMs稳定性的影响。 (2)不同支撑材料的选择及成膜技术研究：膜片电极作为支撑材料,分别尝试了直接沾取成膜，成膜后再次自组装及脂质体成膜等几种不同的BLMs制备方法，考察了不同方法形成脂膜的性能。 (3) BLMs的稳定性考察：琼脂作为支撑材料，进一步考察了膜片电极和电化学铂电极上琼脂支撑BLMs的制备方法，构建了琼脂支撑稳定的BLMs体系。 2.精氨酸多肽偶联抗体制备技术研究 (1)适合偶联修饰物的筛查及偶联方法研究：实验筛选了氨基壬烷，8个精氨酸组成的细胞穿膜肽（R8）等抗体偶联修饰物。以17β-雌二醇抗体为代表，采用碳化二亚胺法实现了R8与抗体的偶联。对反应条件进行了优化，实验最后选择EDC与R8反应的摩尔比为10:1，活化时间为20min，在优化好的条件下，MALDI-TOF-MS分析结果表明R8与抗17β-雌二醇抗体偶联比约为5:1。 (2)修饰前后抗体的活性鉴定：SPR技术考察了抗体修饰前后亲和常数。17β-雌二醇抗体修饰前后的亲和常数分别为3.8509×10~(-5)和2.3233×10~(-6)，亲和能力略有增加，提示R8修饰不影响17β-雌二醇抗体的结合位点及结合活性，可满足下一步的测定要求。实验同时观察到相同摩尔浓度抗体修饰后与抗原结合引起SPR信号响应增大，进一步证实了R8对抗体的修饰。 (3)修饰位点的初步研究：对修饰位点进行了初步研究。利用MALDI-TOF-MS技术，采用trypin酶解方法对修饰前后的雌二醇抗体进行了酶解，修饰R8后抗体在1496.8528Da，1624.9769Da，2013.2524Da处比较强的肽指纹峰消失，在低分子量(600Da)范围内的肽指纹峰增加。实验合成了适用于MALDI-TOF-MS的新基质[CHC][NH3+-Si-SBA-15-Si-NH3+][CHC]，去除了基质信号的干扰，考察了低分子量范围内肽指纹峰的变化。 3. R8偶联抗体修饰BLMs电化学免疫传感技术研究 (1)抗体修饰BLMs的研制：优化了卵磷脂和胆固醇的浓度，卵磷脂浓度为20%，与胆固醇的质量比在4:1-4.5:1之间时，形成的BLMs非常稳定。采用两步自组装方法制备了17β-雌二醇修饰的BLMs，原子力扫描电镜测试了空白成膜液和自组装后成膜液的表面形态，空白的成膜液AFM扫描结果非常光滑，在自组装R8修饰雌二醇抗体后，其AFM扫描结果可看到片片突起，修饰雌二醇抗体后相同电压下BLMs的电流响应值降低。实验对抗体的自组装时间进行了优化，选择30分钟的自组装时间。 (2)17β-雌二醇抗体修饰BLMs传感器构建：以修饰了雌二醇抗体的BLMs作为识别元件，采用竞争结合的方法，利用线性扫描法考察了17β-雌二醇对该生物传感体系的响应。对17β-雌二醇竞争结合物E2-BSA的浓度进行了优化，在检测体系中加入150μL1mg/mLE2-BSA时与抗体的结合基本达到饱和。传感器对17β-雌二醇的响应范围为0.01-0.20ng/mL，最低检出浓度0.01ng/mL，并初步应用于自来水样的测定。在优化好的条件下，考察了体系的抗干扰性能，双酚A，己烯雌酚，4-壬基酚等常见环境雌激素对本体系均无响应。 (3)己烯雌酚抗体修饰BLMs传感器构建：在优化好的条件下，利用R8对己烯雌酚抗体进行修饰，制备了己烯雌酚抗体修饰的BLMs，竞争结合法测定了己烯雌酚对该生物传感体系的响应，建立的传感器响应体系对己烯雌酚的响应范围为0.10-0.20ng/mL，最低检出浓度为0.10ng/mL，传感器对雌二醇，双酚A，4-壬基酚等常见环境雌激素显示了良好的抗干扰性能，也进一步验证了修饰方法和检测体系的可行性。 4. mER修饰BLMs电化学免疫传感技术研究 (1) mER修饰BLMs的构建：利用生物膜上mER与卵磷脂和胆固醇组成成膜液良好的生物相容性实现mER与成膜液的融合，原子力扫描电镜扫描观察到不同于空白成膜液的粗糙突起，进一步证实了mER在成膜液中的存在。 (2)方法条件优化：对成膜条件进行了优化，mER溶液与空白成膜液1:1混合时间为5min。修饰mER的BLMs稳定性良好，在0-1.0V范围内的线性扫描结果表明：相同扫描电压下与空白相比修饰了mER的BLMs膜电流略有增加，也进一步证实了修饰物在BLMs上的镶嵌。 (3) mER修饰BLMs对典型雌激素的响应：采用线性扫描伏安方法考察了mER修饰BLMs对典型雌激素雌二醇的响应，，该体系对17β-雌二醇方法的检出限为1×10~(-10)mol/L，17β-雌二醇浓度大于1×10~(-8)mol/L时结合基本达到饱和。该体系对浓度为1×10~(-5)mol/L双酚A可产生响应，1×10~(-10)mol/L17β-雌二醇和1×10~(-5)mol/L双酚A同时作用时存在协同效应，传感器的响应增强。 本研究建立了水溶性抗体及膜受体两种不同的BLMs表面活性物质固定化方法，通过对成膜条件和修饰方法的摸索，建立了基于细胞穿膜肽R8修饰的BLMs生物传感技术并应用于水中17β-雌二醇，己烯雌酚的检测。建立了基于mER的BLMs生物传感技术并以典型环境雌激素雌二醇和双酚A进行了验证，考察了协同作用效果。相关的研究进一步拓展和完善了BLMs的应用范围，建立的检测技术作为现有环境雌激素检测和筛查方法的有益补充，具有较好的理论价值和应用前景。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.0
【参考文献】
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2369605
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