神经支配的小口径组织工程血管体内构建

发布时间：2019-01-02 08:22

【摘要】：心血管疾病严重威胁着人类的健康，每年有17.3千万人死于心血管疾病。使得血管移植物的临床需求在全球范围内日益增大。外周血管闭塞或损伤替代、冠状动脉旁路移植、血液透析动静脉造瘘等都需要小口径血管移植物。现在肝、肾、肺等复杂器官构建以及大段骨缺损修复等都需要血管化，移植后血管的再通往往是影响构建器官能否存活并宿主化的关键，因而小口径血管的移植和构建也是复杂器官构建的关键科学问题之一。构建不需要体外种植内皮细胞的“现用型”组织工程血管是未来发展的方向。但是小口径组织工程血管（＜6mm）移植后由于早期血栓形成、中远期内膜增生、钙化等问题一直制约着其进一步的临床运用。因此，构建能够长期保持通畅的小口径工程血管仍是世界性的挑战。针对小口径组织工程血管血栓形成和内膜增生的难题，从仿生学入手深入研究血管植入物和血管周围环境的交互作用，能为构建长期通畅的小口径工程血管带来新的突破。工程血管体内植入后首先接触的是流动的血液。血液中有着大量的细胞，其中内皮祖细胞(EPCs)是一种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞，血液中内皮祖细胞含量增高时能直接修复损伤的血管，进而减少内膜增生和血栓形成，降低血管的再狭窄率。组织工程血管迅速内皮化是克服小口径血管血栓形成和内膜增生，提高血管通畅率的有效方法。因此如何促进工程血管内皮化，成为倍受关注的难点和热点。而诱导内皮祖细胞归巢于组织工程血管为其内皮化带来了新的机遇。从解剖生理上看，血管和神经常常形成血管神经束相伴前行，血管和神经的生长方式非常相似，它们循着相同的迁移路线，相互依赖，血管的活动和营养受神经调节。从发育生物学看，血管和神经更是息息相关，血管的发生和轴突的生长可以使用共同信号。轴突的生长可能对血管生物学行为产生重要影响。但是神经因素对工程血管的体内构建是否产生影响尚不清楚（科学问题之一）。尽管内皮化具有重要作用，但小口径PTFE人造血管在内皮化后仍然导致血栓形成，长期移植通畅率不高，是否与其不能降解因而缺乏与周围环境中的神经因素相互作用尚不清楚。那么，神经重建是不是组织工程血管长期通畅的充要条件，是可有可无还是不可或缺（科学问题之二）。冠脉搭桥等需要小口径工程血管，而冠状动脉和颈内外动脉都要受第十对脑神经迷走神经分支的支配，迷走神经起始部位——延髓橄榄后沟富含脑源性神经营养因子（BDNF）。已有研究发现BDNF不仅对神经生长和突触的可塑性有重要作用，而且在整个围血管形成期作用于心脏、骨骼肌和大动脉等特定器官组织。BDNF对于心血管和中心动脉有着比较特异的作用，而冠状动脉、颈动脉等正属于心血管和中央动脉。但BDNF对于用于冠脉搭桥等的工程血管构建有无影响，目前尚不清楚，值得深入研究。在此基础上，要回答神经调控对于工程血管是可有可无，还是不可或缺还必须构建一个神经支配的工程血管，并通过阻断神经支配来进行研究。选择一个同时具有血管效应和神经效应，并且存在各自独立受体的分子非常必要。而BDNF没有独立的血管效应和神经效应的受体，并不适合作为模式分子。筛选轴突生长诱导分子家族Ephrins、Semaphorins、Slits、Netrins，，发现前三者主要功能是抑制，而Netrins的功能是吸引轴突生长。而且Netrins家族在血管和神经轴突的发育过程中都扮演着重要的角色。尤其是Netrin-1不仅诱导神经轴突的生长而且能够促进血管的萌芽和新生。A2b作为腺苷的一个受体也被确认为Netrin-1的受体在改善缺血和抗炎方面发挥作用。DCC作为神经效应受体介导Netrin-1诱导轴突的发育。因此，Netrin-1可以作为一个很好的工具便于我们研究神经调控对工程血管远期通畅的影响及分子机制。围绕这两个重要的科学问题，基于以上研究背景我们展开了以下四个方面的深入研究：一、组织工程血管支架构建及表面修饰选择具有良好力学强度和生物相容性的支架材料是组织工程血管构建的首要要求。我们选择大鼠颈动脉，采用独特的脱细胞技术，保留血管原有的胶原纤维和弹力纤维，用RNA酶，DNA酶、脂肪酶去除核酸和脂肪，得到直径达到1mm，具有良好力学强度，和生物相容性的血管脱细胞基质材料。胶原和壳聚糖都是天然高分子可降解材料，我们利用胶原包裹BDNF孵育已经制备好的血管基质材料，之后通过EDC对孵育了胶原的血管基质材料进行交联。进而在通过SPDP偶联蛋白的方法将BDNF再一次偶联于工程血管内表面，进而构建出BDNF修饰的小口径组织工程血管。扫描电镜发现胶原均匀覆盖血管内表面，进一步检测BDNF已经成功偶联于工程血管内表面。在此基础上为了达到更好的长时程缓释目的，我们将壳聚糖纳米颗粒包裹Netrin-1交联于已经制备好的血管基质材料，再交联胶原。之后通过SPDP进一步偶联Netrin-1于工程血管内表面实现层层自组装，构建了Netrin-1修饰的小口径组织工程血管，并同时针对Netrin-1的不同受体分别构建了A2b受体阻断的小口径组织工程血管和DCC受体阻断的小口径组织工程血管。检测发现Netrin-1能够在工程血管中稳定缓慢均匀释放一个月。二、神经营养因子家族成员通过促进内皮祖细胞募集提高小口径工程血管通畅率鉴于神经营养因子家族成员BDNF对于心血管和中央动脉有特异性的作用，但是其对于冠脉搭桥所需的小口径工程血管有无影响，尚不清楚。我们通过甲基纤维素半固体培养法研究发现BDNF可以促进早期内皮祖细胞单克隆形成和旁分泌。通过旁分泌，进一步促进内皮细胞的增殖和迁移。而且Edu染色和Transwell实验发现BDNF还能明显诱导晚期内皮祖细胞增殖和迁移。并促进晚期内皮祖细胞在胶原电纺丝材料上向内皮细胞分化。通过离体平板流动腔模拟在体血液流变学状态，发现BDNF修饰的涂层胶原材料能够捕获流体中更多的内皮祖细胞，而通过阻断其受体TrkB后，捕获的内皮祖细胞明显减少。通过C57BL/6小鼠铁丝损伤模型发现BDNF能够促进铁丝损伤后C57BL/6小鼠EPCs从骨髓动员到外周。并且BDNF能够促进内皮祖细胞归巢到颈总动脉受损部位。我们进而将构建的BDNF修饰的组织工程血管移植到大鼠颈总动脉，8周后发现对照组仅有一只通畅（n=10），而BDNF修饰的处理组有9只通畅（n=10）。多普勒血流仪检测发现，BDNF修饰的组织工程血管血流量平均4.98ml/min，而对照组组织工程血管平均血流量只有0.46ml/min。将没有完全栓塞的对照组组织工程血管和BDNF修饰的组织工程血管作冰冻切片，发现BDNF修饰的组织工程血管已经形成较为完整的内皮细胞层和平滑肌细胞层，明显优于对照组。我们将组织工程血管剖开作铺片，在共聚焦显微镜下发现BDNF修饰的组织工程血管其内皮化程度明显高于对照组，扫描电镜显示每个高倍视野平均内皮细胞数量是对照组的大约5倍。由此可见，BDNF能够通过促进内皮祖细胞募集诱导组织工程血管内皮化，从而提高小口径工程血管的通畅率。三、神经支配的小口径组织工程血管在体构建及模式分子的生物学功能以上研究我们发现神经营养因子家族成员能够促进小口径工程血管的体内构建，但是神经调控对工程血管的长期通畅是可有可无还是不可或缺，仍然不清楚。我们通过Netrin-1这一模式分子做工具构建了Netrin-1修饰的小口径组织工程血管及其相应的血管效应受体（A2b）阻断组和神经效应受体（DCC）阻断组的小口径组织工程血管。移植2个月后对照组与A2b阻断组基本已经堵塞，而Netrin-1和DCC阻断组保持通畅，但是DCC阻断组有明显的内膜增生。Netrin-1组平均血流为4.53±2.49ml/min，而DCC阻断组平均血流为2.22±1.56ml/min。移植后6个月，Netrin-1组保持通畅，平均血流量4.98±1.97ml/min.。血管外膜和中膜可以看到PGP9.5的阳性表达，提示有神经纤维附着到血管的外膜和中膜。而DCC阻断组工程血管移植6个月后出现了非常严重的内膜增生，通畅率为降为40%（n=10），平滑肌细胞过度增殖，平均血流量为1.66±1.59ml/min。PGP9.5染色无阳性。移植14个月后发现Netrin-1修饰的工程血管仍然通畅，通畅率为91%（n=11），无内膜增生，平滑肌无过度增殖，平均血流为5.47±2.34ml/min。血管外膜和中膜出现明显丰富的PGP9.5阳性表达。而DCC阻断组工程血管基本闭塞，通畅率仅为10%（n=10）。移植后24个月Netrin-1修饰的工程血管仍然保持通畅，通畅率为100%（n=5）。已经有较为完整的神经纤维分布于工程血管周围。可见我们利用Netrin-1这一模式分子成功在体构建了神经支配的小口径组织工程血管。随着神经纤维长入工程血管，工程血管通畅率提高，内膜增生减少；而阻断神经纤维的长入，工程血管的通畅率下降，出现严重的内膜增生。 Netrin-1作为一个模式分子其在小口径工程血管构建中的作用值得深入研究。研究发现在工程血管内皮化前，Netrin-1通过激活A2b受体上调血小板的cAMP水平减少血小板的聚集及粘附；在工程血管内皮化过程中，Netrin-1维持早期EPC干性，增强其旁分泌功能，并促进内皮祖细胞动员和捕获；在工程血管神经化过程中，Netrin-1通过促进神经轴突再生诱导神经元分泌多种活性因子及microRNAs。四、神经调控影响工程血管远期通畅的分子机制有神经纤维生长的工程血管通畅率提高，但是其分子机制如何值得深入研究。我们需要进一步表征神经纤维在工程血管分布的情况和规律。通过血管外膜的神经纤维免疫荧光染色，发现移植后6个月时Netrin-1修饰的小口径组织工程血管已有神经纤维分布于血管外膜，而DCC阻断组几乎没有。14个月时Netrin-1修饰的小口径组织工程血管外膜到中膜都出现神经纤维，而且神经纤维形成网状结构。同时做血管外膜的神经纤维逆行示踪并从血管邻近的颈上神经节观察被示踪到的神经元胞体。血管移植6个月后发现，Netrin-1修饰组，血管移植侧颈上神经节内有较多神经元被示踪，而DCC阻断组颈上神经节仅有少量神经元被示踪，数量明显少于Netrin-1组。移植14个月后，Netrin-1组进行血管移植侧神经纤维逆行示踪可见有更多的神经元胞体在颈上神经节被示踪。而DCC阻断组几乎无神经元被示踪。。通过乙酰胆碱能神经纤维银染发现移植后14个月，Netrin-1组工程血管外膜有乙酰胆碱能神经纤维存在，而DCC阻断组没有发现。并且扫描电镜、Masson染色以及MyCH免疫荧光染色显示神经纤维长入工程血管的程度与工程血管内皮化水平和平滑肌功能重建呈正相关。我们还首次发现microRNA143、microRNA204可以类似激素随着神经纤维的长入被从神经节运输并分泌到保持通畅长达24个月的神经支配的工程血管外膜及中膜，有助于保护血管，防止钙化。并且发现Netrin-1修饰的小口径组织工程血管外膜、中膜和内膜表达BDNF、Netrin-1随着移植时间推移逐渐增多，可能是通过神经纤维的轴浆运输达到工程血管。进一步研究发现BDNF可以通过Erk通路促进平滑肌在胶原上正常增殖，而Netrin-1可以抑制平滑肌细胞病理增殖并促进其功能性骨架蛋白的表达。这对调控工程血管的远期通畅都起到了积极作用。综上所述，本论文通过四个部分的研究，首先利用脱细胞材料和天然高分子材料复合的关键技术，构建了小直径1mm的组织工程血管，并成功控制因子的长时程释放。在此基础上，从工程血管移植后与周围微环境的交互作用入手，发现了神经因子能够调控内皮祖细胞归巢于工程血管从而提高工程血管内皮化水平。进一步构建了神经支配的小口径工程血管，证实了神经长入可以调控工程血管的内皮化水平和平滑肌重建等，从而显著提高了小口径工程血管的远期通畅率。证明了神经调控对于小口径工程血管的远期通畅不是可有可无，而是不可或缺。为构建临床可用的“现用型”小口径组织工程血管奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.11

【参考文献】