周期性应力加载对体外培养肌管极性与分化的影响

发布时间：2019-02-14 11:28

【摘要】：骨骼肌是由平行排列多核极性肌管组成的肌纤维束,各肌管间协同作用,共同完成收缩功能[’]；先天性缺陷、损伤、肿瘤、原发性肌病、代谢性疾病等各种原因容易造成骨骼肌结构缺损和功能丧失。传统治疗方法主要是肌皮瓣移植,但由于可利用的肌肉来源有限,对供区损伤较大,以及异体移植供体来源和免疫排斥等问题,使其应用受到限制[2]；近年来,也有研究者尝试用成肌干细胞移植以促进肌纤维再生,治疗遗传性肌病,但存在移植的成肌细胞在体内分布不均、存活率低及免疫排斥等问题[3]；骨骼肌组织工程的发展给损伤结构和功能的修复带来了希望[4-5],而极性多核肌管的体外培养和活性维持是成功构建功能性再生肌组织的关键因素[6]。近年骨骼肌组织工程研究的重点,在于如何优化成肌干细胞体外培养条件以获得功能性极性多核肌管,研究者在具有导向结构三维支架的应用、对体外培养的分化肌管施加定向的磁力、电及机械拉伸刺激等方面进行了尝试,并取得了一定进展[7-10]。在体组织处于复杂的生长环境,其中力学刺激的作用极大地影响着组织的形态结构和功能。持续性被动张力在人体发育过程中,促进骨骼肌组织的变长、增粗,体力劳动和体育锻炼也能增加肌纤维的数量及直径。生理条件下,力学应激是维持细胞生存和生长的重要细胞外刺激,影响细胞的生长行为,调节细胞的新陈代谢和基因表达过程,在细胞的激活、增殖与分化中扮演重要角色[11-12]。研究表明,力学拉伸加载对成肌细胞具有双向影响,适宜的拉伸能够促进细胞的增殖,而过度拉伸则促使细胞凋亡[13]。力学刺激信号对细胞的生长、发育有何具体影响,又是通过何种途径改变细胞生长状况,已成为细胞生物力学近年的研究热点。国外多个研究组已证实,对构建的肌组织进行周期性的力学加载,模拟体内骨骼肌组织的生长发育过程,能够明显影响再生肌组织的活性、生存周期以及收缩功能[11,14-17]。体外培养条件下,能否获取极性多层肌管,是三维肌组织模型构建成功的关键。成熟肌组织模型内的肌纤维存在平行排列特性,是肌组织发挥收缩功能的形态学基础。Sylgard184属于硅酮橡胶弹性材料,其双组分混合固化后,有柔性基底层特征,表面光滑并具有一定的弹性,便于对弹性基质材料上的极性多层肌管进行力学加载[18]。我们实验组前期对体外三维肌组织构建方面进行了初步探索,运用Matrigel及Ⅰ型胶原修饰的Sylgard支架作为细胞基质与C2C12细胞共培养,获得了极性多层分化肌管。在此基础上,采用自制的体外细胞拉伸仪,我们对柔性基质材料表面粘附生长的三维肌组织模型(极性多层肌管)施以不同频率的周期性应力加载,检测并分析比较不同力学加载条件下肌管的形态特征及分化表型,以筛选优化的肌组织体外应力加载培养条件,探讨不同频率的周期性应力加载对多层肌管极性与分化的影响。此外,我们应用自制细胞拉伸仪和Flexcell力学加载系统,分别对体外三维和平面培养的肌管施以周期性应力加载,比较研究力学加载条件下,不同培养条件对体外培养肌管分化和极性的影响,进一步探究三维极性生长对成熟肌组织模型构建的重要性。本文内容结构第一章体外极性多层肌管的获取及检测 [目的] 利用修饰的铸型Sylgard184三维支架与C2C12细胞复合培养、诱导分化获取体外极性多层肌管,检测肌管的生长和功能特性。 [方法] Sylgard184双组分以10：1的比例均匀混合,倒入6孔板中,室温下静置固化,用PBS液冲洗固化的Sylgard184表面压痕铸型,Matrigel和Ⅰ型胶原(混合比例1：6)混合液均匀铺被凹槽底部,每个凹槽加入混合液0.3ml,确保细胞基质成份的均匀覆盖,自然干燥并紫外消毒,每个Sylgard184铸型凹槽接种2mL浓度为(1.0～2.0)×105个/mL的C2C12细胞悬液,待细胞达80%-90%融合时,弃去全培培养基,加入含2%马血清的DMEM/F12培养液。分化培养7d后,倒置显微镜形态学观察摄片,继续分化至10d后,采用扫描电镜观察肌管形态和肌管间的连接,RT-PCR检测Myogenin、Desmiin、MyHC基因mRNA表达情况,免疫荧光检测分化肌管Desmin、MyHC的蛋白表达。 [结果] C2C12细胞诱导分化7d,形态学观察可见肌管呈极性分化,肌管之间相互融合。继续分化至10d,形态学观察可见肌管之间排列紧密且相互重叠,具有多层分化及极性排列特性；RT-PCR检测证实Myogenin、Desmin、MyHC基因mRNA的阳性表达,免疫荧光检测以及DAPI核染,进一步验证极性肌管内分化特异性标志蛋白Desmin、MyHC的表达：Desmin、MyHC是肌细胞骨架的主要成份,主要分布在胞浆,是骨骼肌分化成熟的标志分子之一,其阳性表达证实再生肌组织的成肌特征以及极性肌管的形成。 [结论] 修饰并铸型的Sylgard184凹槽具有极性引导效应,能够促进C2C12细胞分化形成极性多层肌管,肌管呈极性重叠排列构成三维肌组织模型。第二章不同频率周期性应力加载对体外多层肌管极性及分化的影响 [目的] 探讨不同频率的周期性应力加载对体外培养多层肌管极性与分化的影响,筛选优化的肌组织体外应力加载培养条件。 [方法] 体外培养C2C12成肌细胞于Sylgard184铸槽并诱导分化形成多层肌管组织,采用自制体外细胞拉伸仪,对培养并分化的肌管进行间歇性应力拉伸：加拉伸幅度10%；拉伸频率分别为0(A组)、0.25(B组)、0.50(C组)、1.00Hz(D组),拉伸时间3次/d,每次30min,各组分别于连续分化拉伸5、7、10d时,观察不同加载条件下的肌管形态；RT-PCR和qPCR分析检测成肌相关基因MyoD、Myogenin、Desmin、MyHC的mRNA表达差异。 [结果] 倒置显微镜观察证实,应力加载促进肌管的极性融合及数量增加,B组加载培养7d时,多层肌管排列紧密,极性明显。加载条件能够促进成肌相关基因的mRNA表达,B组加载培养7d时,成肌分化相关基因Myogeni、Desmin、MyHC的mRNA表达量最高。D组加载培养10d时,肌管的脱落和死亡加速,MyoD、 Myogenin、Desmin、MyHC的表达降低。 [结论] 低频(0.25Hz)、适时(7d)的周期性应力加载有利于生长于Sylgard弹性材料表面的多层肌管组织的极性分化,但随着应力加载时间的延长,肌管的老化加速。第三章应力加载对体外三维和平面培养肌管分化和极性影响的比较研究 [目的] 探讨力学加载条件下,三维和平面不同的培养条件,对体外分化肌管分化和极性的影响,进一步探究三维极性生长对成熟肌组织模型构建的重要性。[方法] 体外培养C2C12细胞于BioFlex柔性基底膜表面并诱导分化形成单层肌管,采用细胞柔性基底加载装置Flexcell,对培养并分化的肌管进行加载幅度10%、加载频率0.25Hz的周期性力学加载,加载时间为3次/d,每次30min,分化拉伸7d,加载组记为B组；未加载,正常分化培养组记为A组。同时,体外培养C2C12细胞于Sylgard184铸槽表面并诱导分化形成多层肌管组织,采用自制体外细胞拉伸仪,对分化培养的肌管进行力学加载,加载条件同前,并记为D组；未加载,正常分化培养组记为C组。倒置显微镜观察不同拉伸培养条件下的肌管形态差异；RT-PCR和qPCR检测并分析Myogemin、Desmin、MyHC的nRNA表达差异；免疫荧光检测成肌分化标志蛋白MyHC的表达及极性分化情况。 [结果] 倒置显微镜观察证实,力学加载对不同培养条件下的肌管的极性排列均起到促进作用；与平面培养条件相比,不管是力学加载还是非加载条件,三维培养均能够促进肌管的融合、数量的增加和极性排列。PCR检测证实,D组Myogenin、Desmiin、MyHC的mRNA表达量最高,与A、B、C组比较差异均具有统计学意义(P0.05)；B组Myogenin、Desmin、MyHC的mRNA表达量最低,与A、C、D组比较差异均具有统计学意义(P0.05)；C组Myogenin、 MyHC的mRNA表达量比A组高,差异具有统计学意义(P0.05)。免疫荧光结果显示,三维培养条件下,MyHC显著增高且极性排列更加明显。 [结论] 与平面培养条件相比,三维培养条件能够促进肌管的极性与分化,并且适宜的应力加载进一步增强其促进作用；虽然,应力加载在一定程度上能够促进平面培养的肌管的极性排列,但对肌管的分化起到抑制作用。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R318.01

【参考文献】