纳米材料作为siRNA载体及其与细胞的相互作用研究

发布时间：2019-02-14 12:22

【摘要】：RNA干扰(RNAi)在针对肿瘤、病毒感染和糖尿病等疾病的治疗中具有非常大的应用潜力。虽然RNAi的作用原理已经明晰,但是能够有效递送siRNA的载体十分有限,因而极大地限制了RNAi的临床应用。尽管基于病毒载体的RNAi在具有靶向性的同时显示出高转染效率,但病毒的应用可能引起潜在的突变,也有可能带来免疫原性等问题。纳米材料是一类典型的非病毒载体,具有小尺寸、易修饰等优点,而且能够有效地携带siRNA进入细胞并诱导RNAi效应。但是,纳米毒理学的研究结果表明,各种纳米材料均有不同程度的细胞毒性。因此,研究纳米材料与siRNA的结合,以及与细胞之间的相互作用,例如细胞摄入、定位和转归等,可以为设计更安全和高效的siRNA递送载体提供理论依据。本研究以金纳米棒(AuNRs)和合成高分子普鲁兰精胺(Ps)多糖作为siRNA载体,研究它们对乳腺癌细胞中目的蛋白表达水平的影响,同时分析和探讨上述载体与细胞之间的相互作用。取得了如下主要研究结果： 1.电子显微镜观察结果表明,AuNRs可以通过内吞途径进入乳腺癌肿瘤细胞,然后进入到溶酶体成熟途径,最终以聚集体的形式定位在残余小体中。位于这些囊泡结构中的AuNRs可以通过外排的方式被排出；但是,在静态培养条件下,外排的AuNRs可以再次被内吞而重新进入细胞。只有极少量AuNRs可以从溶酶体逃逸到细胞质中,但是,细胞的保护性自噬可以将其重新限制在溶酶体结构中。细胞内的AuNRs主要依靠细胞分裂而得以稀释。上述过程保证了细胞核、线粒体和内质网等重要细胞器不会直接接触到AuNRs,由此阐释了AuNRs的良好生物相容性。 2.为了对细胞内的AuNRs进行定量表征,建立了一种基于紫外—可见—近红外(UV-Vis-NIR)吸收光谱的定量分析方法,可对进入乳腺癌细胞中的AuNRs进行实时分析。与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)方法相比,该方法可以实现对活细胞内的AuNRs进行定量,并分析AuNRs在细胞内的分散状态,且操作简单,价格低廉。 3.研究结果表明,表面带有正电荷的AuNRs作为PAR-1siRNA的载体,可以显著下调乳腺癌细胞中PAR-1蛋白的表达,有效抑制了细胞的迁移能力。与此同时,细胞毒性实验结果表明,与商业化载体lipofectamine2000和TurboFect相比,AuNRs具有良好的生物相容性。上述结果提示,AuNRs结合PAR-1siRNA可以作为一种抑制乳腺癌转移的策略。 4.以精胺化多糖(Ps)作为siRNA载体,系统研究了培养基中血清含量对普鲁兰精胺与siRNA复合物颗粒(Ps-siRNA)尺寸的影响,分析了这种影响与RNAi干扰效率之间的关系。结果表明,Ps-siRNA在低血清条件下发生聚集,形成微米尺度的聚集体,经过细胞内吞而定位于溶酶体中,使单个溶酶体内有更多的亚氨基,从而引起更强的质子海绵效应,导致溶酶体肿胀,有利于siRNA分子从溶酶体逃逸,获得较高的干扰效率。但是在低血清条件下Ps-siRNA的聚集也导致了更高的细胞毒性。这可能是由于Ps-siRNA聚集体沉降至细胞表面后引起细胞膜的损伤而导致细胞的死亡。在高血清条件下,Ps-siRNA的分散性良好但是溶酶体逃逸能力低,从而介导的RNAi效应也弱。但是高血清条件下Ps-siRNA的良好分散性可以有效降低其相应的细胞毒性。在氯喹的后处理作用下,可以大幅度地提高Ps-siRNA在高血清条件下的RNAi效率。上述结果说明,可以通过调控培养基内血清的含量来平衡干扰效率和细胞毒性。 综上所述,本文的研究结果为研发新型siRNA载体、提高RNAi效率和降低载体的细胞毒性提供了理论依据和基础实验数据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08

【共引文献】

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本文编号：2422200