【摘要】：单分散、球形纳/微米生物活性玻璃颗粒(NMBGs)作为药物载体、基因载体、骨组织工程支架和创面修复材料都具有广阔的应用前景,但其对细胞学性能的影响没有得到系统的研究,特别是球形生物活性玻璃颗粒的粒径对细胞性能的影响至今未见报道。本论文以十二胺为催化剂和模板剂,通过控制十二胺的浓度可精确控制生物活性玻璃微球的粒径从61 nm到1085 nm。制备的生物活性玻璃具有完美的球形形态、单分散性好、粒度分布范围窄且具有多级结构。NMBGs颗粒中Ca2+主要分布在表面,形成一个阳离子壳层。在模拟体液(SBF)中的降解实验显示,Ca的离子浓度在1d时达到峰值,Si离子释放3 d时达到一个稳定的阶段,并且3 d时颗粒表面有大量的针状羟基磷灰石晶体附着,将颗粒连接在一起。细胞毒性研究显示,NMBGs(从Group-61nm到Group-1085nm)对MC3T3-E1细胞代谢活性及细胞增殖能力的影响具有粒度、浓度和时间依赖效应,粒径越大浓度越高的颗粒会引起更大的细胞毒性。而随着共培养时间的延长,与低浓度(50μg/m L)和小粒径生物活性玻璃颗粒(Group-61nm,Group-174nm和Group-327nm)共培养的细胞活性反而能部分恢复,说明NMBGs对细胞代谢和增殖能力的影响不是永久性行为。细胞凋亡实验显示,只有150μg/m L的NMBGs会引起明显细胞凋亡,且细胞凋亡除Group-61nm组外也具有粒度依赖效应,粒径的越大的颗粒引起的细胞凋亡越明显。细胞形态的改变也具有粒度、浓度和时间依赖效应,粒径越大浓度越高的颗粒会引起细胞更大的形态改变(100和150μg/mL浓度下,Group-743nm组、Group-990nm和Group-1085nm组细胞量少,细胞皱缩成团,单个细胞瘦长且细胞核不够清晰,细胞有大量的色素凝聚或是染色质的固缩),而在低浓度组(50μg/m L)和小粒度组(Group-61nm,Group-174nm和Group-327nm)随共培养时间的延长,细胞形态的改变能部分恢复。细胞微观结构的改变也具有粒度依赖性,随着粒径增大运输泡增多,微绒毛变少,线粒体脊变得模糊。MC3T3-E1细胞通过吞噬的形式实现NMBGs的内在化,通过运输泡运输颗粒。NMBGs通过MC3T3-E1细胞核周边的细胞膜粘附并被吞噬,而不会被细胞核上方的细胞膜吞噬。吞噬颗粒的尺寸受细胞大小和细胞内空间的限制。进入细胞后,小颗粒(Group-61nm和Group-174nm)被溶酶体吞噬并倾向于滞留在溶酶体内,将被逐步降解,大颗粒(粒径大于174nm)将从溶酶体逃逸进细胞质,引起溶酶体破裂而导致细胞凋亡。颗粒在细胞内的降解实验显示,NMBGs被细胞吞噬后,Ca离子最先从NMBGs中释放出来,在10 d时可释放完全。磷酸根也从玻璃网络中解离下来进入细胞质中并在7 d时释放完。Si-O网络在细胞内遭到层层瓦解剥离,在此过程中NMBGs基本维持近似球形或椭球形形貌,边缘和表面变得粗糙,最后在细胞质中形成一些模糊的痕迹,则整个颗粒被降解掉。NMBGs在细胞内的不同位置降解程度不同,在胞内体内相比在细胞质内降解的更快。细胞在材料上粘附的形态学研究显示,细胞完全平铺在材料上,相比Blank铺展程度更好,说明NMBGs(除Group-1085nm组)对细胞的铺展还是非常有利的。Group-1085nm组和Group-77S组会导致粘附在材料上的细胞部分破裂,造成细胞的死亡,这说明大颗粒不利于细胞的粘附。细胞在30min时可以部分吞噬NMBGs,在颗粒浓度为150μg/m L时细胞的粘附性具有粒径依赖性,随着颗粒尺寸的增大,4h时粘附的细胞数量下降,特别是Group-990nm组和Group-1085nm组与Blank相比其下降的程度具显著性差异(p0.05)。NMBGs的内吞会破坏细胞的微丝或阻碍微丝的重构。微丝的破坏程度和颗粒的粒径之间存在一定的依赖性关系,粒径越大微丝破坏程度越大,NMBGs对微丝的破坏程度与细胞迁移程度基本一致。在10%FBS浓度下,迁移实验主要受颗粒粒径的影响。50μg/m L的浓度下,细胞的迁移性基本表现出粒径依赖性,即随着颗粒粒径的增大迁移速度下降但无统计学差异。NMBGs各组细胞-细胞连接完整。Group-77S组因为颗粒的沉积使细胞-细胞之间的连接变得不够紧密,且沉积在划痕区的颗粒阻碍了龙头细胞的迁移速率导致整体迁移速率的降低。通过以上分析我们得出,球形的纳/微米生物活性玻璃粒径在61 nm到327 nm,浓度低于100μg/m L时更安全。因此,这种粒径和浓度的纳/微米生物活性玻璃球形颗粒做为药物、基因载体或组织工程支架材料更有应用前景。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【共引文献】
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