采用相转化法制备的可降解生物多孔3D和4D支架修复骨缺损

发布时间：2019-10-13 08:48

【摘要】：使用生物材料修复受损组织的历史要追溯到史前，距今已经30,000年了。2000年前智慧的中国和罗马人民已经会使用金子修复受损的牙齿。随着当今社会创伤，肿瘤，畸形，退化和老龄化的急剧增加，外科重建手术材料的需求亦是与日俱增。根据国际骨质疏松基金会（International Osteoporosis Foundation, IOF）发布的2009年亚洲审计报告，中国大陆超过50岁的人群中有694万人患有骨质疏松，每年由骨质疏松导致的髋部骨折约687,000例，脊柱骨折18万例。在过去四十年，中国香港髋部骨折增长了300%，新加坡增长了500%。日本的骨质疏松人群大约120万，髋部骨折发生率在老年人群（大于75岁）中显著增加。全球权威调研机构Technavio分析师预测2012年到2016年之间矫形合同制造市场的复合年增长率（Compound Annual Growth Rate, CAGR）将增长11.05%。新材料在线网站‖（http://www.xincailiao.com/）提供的数据显示目前全球生物材料以骨科和心血管两类应用产品的需求量最大，分别占全球生物材料市场的37.5%和36.1%；其次以伤口护理和整形外科为主，约占全球生物材料市场的9.6%和8.4%；到2015年全球骨科市场规模达472亿美元，中国达到166亿人民币，成为全球第二大骨科市场。矫形重建术的增多直接刺激了骨替代材料的发展。多孔支架材料在骨重建领域受到广泛关注，究其原因就是为骨组织的长入提供了足够的空间和时间。然而目前的支架材料仍然存在一些缺陷，a.目前市售的很多骨替代多孔支架材料很多是多孔闭塞支架‖，使用这样的支架修复骨缺损时，常常会出现这种情况：新鲜营养物质到达支架内部之前原来的营养物质已经消耗殆尽，而且产生了大量的新陈代谢废物。这种情况使得刚刚长入到内部的细胞死亡，实验中常常发现细胞仅仅集中在支架材料的周围；b.目前预成型的支架材料在使用过程中也遇到了一些问题：初始机械强度不高，手术操作性差，与不规则骨缺损不匹配等。本研究针对目前材料存在的缺陷对材料进行改进。第一部分：带有微通道的生物多孔支架修复兔桡骨骨缺损。为了解决以往3D组织工程支架存在的物质交换障碍的问题，本部分采用相转化方法制备了一种新型的带有微通道的可降解生物多孔支架材料。将一定量的PLGA（MW=7.5万或14.7万）溶于NMP中，然后加入一定量的HA后使用乳化机充分分散均匀。选择直径为200-450μm的盐粒子作为致孔剂加入到上述混合物，将复合材料加入到自制的模具后放入一次水中浸泡3天即可得到多孔材料（PS支架）。通过扫描电镜观察到孔隙表面和断层表面观察到相互连通的微通道（直径1μm左右），这些微通道非常有利于孔隙内外离子，小分子物质和大分子物质的交换。通过压缩试验我们可以得到压缩强度在1MPa-4MPa范围内的支架材料，可以根据使用部位进行选择。体内外实验我们选择强度较大的支架材料进行。细胞实验中通过与模压成型方法制备的材料（MM支架）进行比较观察材料的细胞增殖能力和诱导成骨能力，结果发现细胞培养5d和10d后细胞增殖量明显高于MM支架，这说明由于PS支架良好的通透性，支架内部的细胞获得了必要的营养物质，而MM支架由于物质交换障碍而影响了细胞的增殖。培养10d时碱性磷酸酶含量明显高于MM支架，14d和21d钙沉积量明显高于MM支架。原因可能是材料表面的HA暴露较多，起到了诱导成骨分化的作用。PS支架体内骨修复能力也同样优于MM支架，通过X片可以观察到PS支架内部矿化骨质，而MM支架仅集中在支架周围。第二部分：可注射聚丙交酯-乙交酯/纳米羟基磷灰石/可降解明胶微球复合支架（PLGA/HA/MGs）修复小鼠颅骨缺损。为了解决以往预成型支架拟合度欠佳，操作性差，以及可注射水凝胶机械强度差的问题。我们制备了可注射的PLGA/HA/MGs复合支架，其中未交联明胶微球（MGs）作为体内致孔剂和担载rhBMP-2。方法是将一定量的PLGA溶于NMP中，然后加入HA，制得的混合物用乳化器乳化3分钟。然后在混合物中加入未交联的明胶微球（MGs）或载rhBMP-2的MGs作为致孔剂。选择2mL的注射器（出口直径约2.7mm，相当于16号穿刺针的直径）将材料分装到注射器管内。最终得到的是可注射的骨修复替代材料。通过调节复合材料中PLGA分子量，浓度，HA含量以及MGs的量得到满意的可注射材料，既能够顺利注射，又能够得到较高的机械强度。同时我们对材料的细胞毒性进行评估，发现材料在0-2h细胞毒性明显，2h后无细胞毒性。同时将材料和载rhBMP-2的材料用于小鼠颅骨修复，发现两组骨修复效果优于空白组，其中载rhBMP-2组最佳。同时我们通过小鼠的心，肝，脾，肺，肾组织切片观察发现材料未造成小鼠体内脏器损伤。第三部分：可注射4D支架修复兔桡骨骨缺损。预成型支架材料在动物实验和临床使用中存在诸多缺陷，例如机械性能较差，手术操作性差，与不规则骨缺损拟合度差等。可注射水凝胶因其可原位塑性，并可微创操作，与缺损拟合度好而应用增加。但是水凝胶不具有足够的机械性能用于负重区域，甚至在非负重区域材料的机械强度也不能够维持空隙的空间结构。4D支架是在3D空间支架的基础上加上时间的概念。今天，4D概念经常出现在之前的文章中。例如，4D CT现已经用于临床诊断和导航；下肢4D数字模型用于研究全髋关节置换术并发症；4D打印用于制备形状记忆型器件。这些技术激发我们设计一种支架材料，这种支架材料在早期是一种无空隙设计，可提供足够的机械强度；随着时间材料空隙从外而内逐渐形成，周围骨组织逐渐长入。本研究中，我们将明胶微球加入到PLGA，HA和NMP的混合物中制备4D支架。这种支架材料可以实现原位成形，并可出现时间依赖性孔形成。原因是明胶材料可被明胶酶如组织金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9)降解，而MMP-2/9可在正常生理和病理状态下的骨组织中检测到。通过其修复骨缺损的结果可见，材料移植入骨缺损处后观察期间未见断裂，支架早期出现矿化，后期骨组织逐渐长入，最后完成骨缺损部位的修复。而载有rhBMP-2的支架骨修复能力更佳。通过上述研究我们在以下方面改善了目前支架材料存在的问题：1.设计和制备了带有“微通道”的3D骨替代材料，增强支架内外的“交流”，在体内促进了骨组织的修复；2.设计和制备了可注射的3D骨修复材料，实现材料与宿主不规则骨缺损的形态匹配，，并且材料具有较高的机械强度；3.设计和制备了可注射4D骨修复支架材料，实现早期高强度，后期高孔隙率，与宿主骨缺损高拟合度等目的。
【图文】：

分层结构,等级

图 1.1 骨等级分层结构Fig1.1 Hierarchical structural organization of bone（a）皮质和松质骨；（b）骨单位（哈弗氏系统）；（c）骨板；（d）胶原纤维；（e）骨矿物质晶体胶原分子，非胶原蛋白。(a) cortical and cancellous bone; (b) osteons with Haversian systems;(c) lamella; (d)collagen fibassemblies of collagen fibrils;(e)bone mineral crystals, collagen molecules, and non-collagenous proteins骨皮质是一种分层结构。它有微米级的骨单位，纳米级的胶原纤维和低于纳米的原分子组成。图 1.2（a）是密质骨的断层图，从中我们可以看到带有血管的圆柱形骨位以哈弗氏管为中心走行[15]。哈弗系统顺骨干长轴平行排列，哈弗管之间借伏克曼（Volkmann canal）相连接，后者并与骨皮质内外表面相通。新陈代谢物质通过微管微腔隙和付克曼管与骨髓腔进行交流。图 2（b）所示[17]为松质骨的多孔结构，由相连接的骨小梁编织而成。松质骨提供了一个开放的低密度，多孔隙的结构，而皮质骨一种高密度，几乎封闭的孔结构（图 2c）[18]。骨小梁内看不到哈弗氏管，因此松质

骨形态

图 1.2 骨形态Fig.2. Bone morphologies（a）光学显微镜下观察到的皮质骨横截面断层微观结构；（b）扫描电镜下显示的松质骨微观结构；（c）高倍显微镜下观察的脱钙松质骨的组织结构（H&E 染色图片），其中 bm 指的是骨基质，cc 是钙化的软骨，end 是骨内的成骨细胞。(a) optical micrograph of transverse cross-section showing the microstructure of compact lamellabone human femora[17,19]; (b) SEM image of cancellous bone[20]; (c) high magnification histologicasection image of trabecula in human cancellous bone by decalcified preparation; bm bone matrix; cc calcified cartilage; end endosteal osteoblasts.骨内含有的主要是 I 型胶原和少量的 V 型胶原。在微米级水平，胶原纤维是组成骨板的主要成分。胶原纤维的直径在 100-2,000 nm 之间变化，由规整排列的原胶原蛋白组成。在空间结构上，胶原蛋白显示出特殊的三股螺旋缠绕的结构，三条相互独立的胶原蛋白肽链依靠甘氨酸之间形成的氢键维系三股螺旋相互缠绕的结构。胶原蛋白这种特殊的三股螺旋结构保证了它的机械强度。这种三股螺旋就是原胶原。胶原纤维是胶原蛋白
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08

【共引文献】