阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞生物活性影响的实验研究

发布时间：2020-02-10 02:13

【摘要】：第一部分人工关节钛假体表面阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜的制备及表征测试目的：利用真空脉冲磁过滤阴极弧等离子体制备二氧化钛及含氮二氧化钛薄膜，并对其表面特征进行检测。方法：采用真空脉冲磁过滤阴极弧等离子体二氧化钛及含氮二氧化钛薄膜，分别采用纯氧气及氧/氮混合气氛，进行沉积；技术参数为：直流电压40V、负偏压-500V；脉冲占空比15%、脉冲频率7Hz、脉冲宽度2000μs；沉积时间2小时。样品掺氮后，于450℃热处理30min。未掺氮的纯钛片做为空白对照。采用X线光电子能谱对表面元素组成进行分析；测量三组样品的接触角；采用Surpass电位运动分析仪测量三组样品表面的Zeta电位。结果：采用阴极弧等离子体沉积技术未明显改变钛基体的表面形貌，并可成功将氮元素沉积于二氧化钛薄膜表面；纯钛组、二氧化钛组及含氮二氧化钛薄膜组表面的接触角分别为88.1±1.5°、41.5±5.6°及38.4±5.0°；在掺氮后中性或偏碱性的环境下，含氮二氧化钛薄膜表面有更多负电荷。结论：采用真空磁过滤阴极弧等离子体沉积技术，可以成功将氮元素沉积于二氧化钛薄膜中，对钛基体表面的二氧化钛薄膜进行改性。在不影响钛基体表面形态的情况，氮元素的成功的沉积到薄膜中，并改善了钛基体的表面亲水性；在生理pH下使钛基体呈现较多的负电荷。第二部分阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞粘附的影响目的：研究探索阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞粘附的影响。方法：采用阴极弧沉积制备二氧化钛及含氮二氧化钛薄膜；将一定密度的MG63成骨细胞接种于不同样品表面，于2、4、6、12h终止培养，采用CCK-8法定量分析四个时间点MG63细胞在材料表面粘附的数量；于2、6、12h终止培养采用DAPI对三个时间点在材料表面粘附的MG64细胞核进行染色，观察粘附于材料表面细胞数量；于2、6、12、24h终止培养，对四个时间点在材料表面粘附的MG64细胞进行鬼笔环肽及DAPI双染，动态观察MG63细胞形态及细胞骨架蛋白的变化；扫描电镜观察24h成骨细胞在不同样品表面的形态；接种细胞后培养24h，用移液管枪头划伤细胞层，继续培养24h，采用鬼笔环肽及DAPI双染，观察细胞在不同样品表面的迁移。采用定量RT-PCR检测2、6、12、24h MG63成骨细胞Integrin-β1基因表达水平；结果：4、6、12h，含氮二氧化钛薄膜表面粘附的MG63细胞明显多于其他两组，差异有统计学意义；动态细胞形态及骨架蛋白观察显示，含氮二氧化钛表面的成骨细胞较早表达细胞骨架蛋白；扫描电镜显示含氮二氧化钛薄膜的MG63细胞，更加平坦，且细胞铺展面积大；含氮二氧化钛薄膜表面有较多MG63细胞迁徙至划伤区域的中心；在培养12h后，二氧化钛组及含氮二氧化钛薄膜表面MG63细胞Integrin-β1基因表达较纯钛组增加明显，但二氧化钛组与含氮二氧化钛薄膜间无明显差异；结论：含氮二氧化钛薄膜能够明显的促进成骨细胞的粘附及迁移。其可能机制是生理pH下使薄膜表面负电荷增多，通过粘附相关蛋白吸附及构象的改变，，促进了成骨细胞表面整合素的结合，进而促进了成骨细胞的粘附和迁移，表面阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜可以增加其生物活性。第三部分阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞增殖的影响目的：研究探索阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞增殖的影响。方法：采用阴极弧沉积制备二氧化钛及含氮二氧化钛薄膜；将一定密度的MG63成骨细胞接种于不同样品表面，采用CCK-8定量分析1、4、7天MG63细胞在不同样品表面增殖数量；通过吖啶橙对1、4、7天三组样品表面的MG63细胞进行染色，观察成骨细胞的增殖情况；流式细胞仪分析1、4、7天成骨细胞在不同样品表面细胞周期情况。结果：培养4天后，含氮二氧化钛薄膜表面的细胞增殖活性高于纯钛组；培养7天时，含氮二氧化钛薄膜表面细胞数量多于纯钛组及二氧化钛组。吖啶橙染色结果与CCK-8结果一致；在培养4天时，含氮二氧化钛薄膜表面的MG63细胞G0/G1的百分比明显低于其余两组，而S期及G2/M期的比例明显升高。结论：阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜能够促进成骨细胞的增殖，可能的机制是掺氮使二氧化钛在生理pH下呈负电位，增加或改变吸附蛋白的性质，促进了成骨细胞的增殖；调节增殖的机制可能与加速细胞周期中S期、G2/M期有关。第四部分阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞分化的影响目的：研究探索阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞分化的影响。方法：采用阴极弧沉积制备二氧化钛及含氮二氧化钛薄膜；将一定密度的MG63成骨细胞接种于不同样品表面，于1、4、7天收集样本，检测碱性磷酸酶的活性；采用定量RT-PCR检测1、4、7成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶、I型胶原基因的表达情况；采用免疫荧光染色对7、10天骨桥蛋白进行染色，同时采用Western-blot检测骨桥蛋白的表达情况。结果：培养至4、7天，含氮二氧化钛薄膜及二氧化钛表面的成骨细胞碱性磷酸酶表达较纯钛组明显增高，但含氮二氧化钛薄膜与二氧化钛组成骨细胞碱性磷酸酶无统计学差异；培养4天后，含氮二氧化钛薄膜表面的MG63成骨细胞碱性磷酸酶基因表达高于纯钛组及二氧化钛组；培养7天后，只有含氮二氧化钛薄膜与纯钛组之间MG63成骨细胞的碱性磷酸酶基因表达量有显著差异；培养4天后，含氮二氧化钛薄膜表面的MG63成骨细胞I型胶原基因表达高于纯钛组及二氧化钛组，含氮二氧化钛薄膜虽高于二氧化钛组，但无统计学差异；培养7天后，三组样品表面MG63细胞I型胶原的表达量都明显增加，含氮二氧化钛薄膜明显高于其余两组；培养7天时三组的骨桥蛋白表达量少；至第10天，OPN的表达增多，含氮二氧化钛薄膜表面MG63成骨细胞骨桥蛋白表达高于纯钛组及二氧化钛组，免疫荧光染色与Western-blot结果基本一致；结论：含氮二氧化钛薄膜不仅能促进MG63细胞早期成骨分化标志物的表达水平，同时也提高了中晚期分化及矿化相关标志的表达水平，表明阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜能够促进成骨细胞的分化及矿化。
【图文】：

表面形貌,二氧化钛,面形,扫描电镜

图 1 纯钛组(A)、二氧化钛组(B)、含氮二氧化钛组(C)样品表面形貌扫描电镜结果(Bar=20μm由扫面电镜结果(图 1)可知，纯钛组样品表面略有些小沟，可能与样品碳化硅抛光有关，体上较为光滑；二氧化钛组及含氮二氧化钛组样品表面形貌相似，有少量点状凹陷；说明采极弧等离子体沉积技术未明显改变钛基体的表面形貌。、样品表面元素分析

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图 2 二氧化钛组及含氮二氧化钛薄膜组 XPS 全谱图(A)；含氮二氧化钛薄膜表面 Ti2p、N1s、O1s 的高分辨谱(B)；N 元素高分辨曲线拟合图(C)图 2 显示了二氧化钛及二氧化钛薄膜表面的元素组成 X 射线光电子能谱的结果。由图 2可知，两组样品表面元素组成基本一致，主要的特征峰有 Ti3p、C1s、Ti2p 及 O1s，其结合能分别为 37eV、285eV、459eV 及 531eV。样品表面的 C1s 主要是由于丙酮、乙醇等有机溶剂清洗及吸附空气 CO2所致。仔细观察二氧化钛薄膜 XPS 全谱图，可以发现在结合能大约 400 eV 处有个弱峰，即为 N1s 的特征峰。说明阴极弧沉积技术成功制备了含氮的二氧化钛薄膜。图 2B 为含氮二氧化钛薄膜表面 Ti2p、N1s、O1s 的高分辨谱。其中 Ti2p 能级的高分辨扫描图，在 459.15 和464.9eV 有两个拟合峰，其分别对应于 Ti2p1/2 及 Ti2p3/2 轨道同 O1s 轨道形成 Ti-O 化学键的结合能。图 2B 中 O1s 能级的高分辨图中只有一个特征峰，其结合能为 530.6eV，其对应于 O1s 轨道与 Ti2p 轨道形成的 Ti-O 键的结合能。由 XPS 结果中 Ti 及 O 的轨道结合能可以确定，含氮二氧化钛薄膜表面 Ti2p 及 O1s 的化合态分别为 Ti4+及 O2-，从而可以进一步确定二氧化钛的存在。图 2C 为对 N1s 能级进行 Gaussian 拟合，分别于 396.82、400.32、402.18eV 三处出现特征峰位。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.1

【共引文献】