新型含槲皮素复合骨替代材料的制备、生物学性能及骨修复功能研究

发布时间：2020-03-20 23:55

【摘要】：研究背景及目的骨质缺损是临床治疗的难点,目前迫切需要研究新型的人工骨替代材料。本实验室前期研究显示α半水硫酸钙/纳米羟基磷灰石(α-CSH/n-HA)复合材料具有良好的生物相容性和骨传导性,但骨诱导性能较弱。因此,本课题创新性地将骨诱导性能良好的槲皮素(Quercetin)与α-CSH/n-HA复合,以期得到一种性能更为理想的新型材料。研究方法1.材料的制备与性能检测机械混合法制备Q-α-CSH/n-HA。X-ray衍射实验(XRD)、傅里叶红外扫描(FTIR)、扫描电镜(SEM)、压强实验及X-ray能谱分析(EDX)分别检测材料的晶体结构、表面特征、机械强度及元素构成;体外降解实验及Ca2+与Quercetin浓度测定。2.BMSCs细胞实验制备材料浸提液并检测Ca2+与Quercetin浓度;MTT法、CCK-8法及划痕实验分别检测细胞毒性、增殖情况及迁移能力;qRT-PCR检测成骨分化基因表达;茜素红及von kossa染色检测成骨矿化能力。3.动物实验分别建立年轻与年老两批SD大鼠胫骨临界性骨缺损模型并植入Q-α-CSH/n-HA(0%、0.5%、1.5%和3%)。X-ray和micro-CT检测骨缺损修复和新骨形成;HE、Goldner及Safranin O染色观察新骨生成及材料降解情况;免疫荧光法观察RUNX2/OSX/OCN阳性细胞数;CFU法检测克隆集落形成能力;测定大鼠血清Ca2+浓度。研究结果1.XRD、FTIR及EDX结果显示Q-α-CSH/n-HA的衍射光谱、红外光谱及元素构成与α-CSH/n-HA类似,但降解后的材料元素构成更复杂;SEM显示Quercetin的加入增加了材料的微球数目,降解后孔隙率明显增加;Quercetin的加入导致材料机械强度递减,但仍高于正常人体松质骨水平;Quercetin对复合材料的降解速度及降解液中Ca2+水平无明显影响,但Quercetin浓度递增。2.随着Quercetin 比重的增加,浸提液中Ca2+浓度无差异,Quercetin浓度递增,大鼠BMSCs增殖率增加,迁移能力增强,TNF-α表达下调,OSX/RUNX2/OCN/ALP/BMP-2/OPN/BSP/Smad2/TGF-β表达上调,成骨分化及矿化能力增强,其中1.5%Q组效果最明显;所有实验组均无细胞毒性。3.X-ray和Micro-CT结果显示含Quercetin的材料组骨缺损的修复速度和新生骨的形成均较对照组明显增加;病理染色结果显示Quercetin能明显促进新生骨质、血管的生成和材料降解吸收;免疫荧光法观察到Quercetin能明显增加RUNX2/OSX/OCN阳性细胞数;以上效应在年轻大鼠中1.5%Q组最好,年老大鼠中3%Q组最好。血清Ca2+浓度只有年轻大鼠1.5%Q组明显高于对照组;CFU法结果显示年轻大鼠1.5%Q组与年老大鼠3%Q组均明显优于对照组。主要结论1.Quercetin能明显增加复合材料表面微球结构、降解后孔隙率及药物释放量,对材料的理化性质无明显负面影响。2.体外实验:Q-α-CSH/n-HA具有良好的生物安全性;Quercetin能有效增强BMSCs的增殖、迁移、成骨分化及矿化成熟能力,具有理想的骨诱导性。3.体内实验:Q-α-CSH/n-HA在体内生物降解后所形成的多孔腔隙结构更有利于骨质缺损的修复和n-HA的重吸收,更具整体修复效果。Quercetin、Ca2+的释放可能协同作用改变了造模区域的微环境,同时Quercetin的抗衰老效应与骨诱导效应也可能协同作用,共同促进了大鼠BMSCs的增殖、迁移、募集及成骨分化;Q-α-CSH/n-HA的降解、吸收、机化、血管长入,成骨细胞的矿化成熟以及新生骨质的形成之间可能保持动态平衡,并最终促进了骨质缺损的修复重建。
【图文】：

逑Ｗ１邋Ｗ２邋Ｗ３邋Ｗ４邋Ｗ５逦Ｗ６邋Ｗ７邋Ｗ８逡逑图１－７不同含槲皮素浓度复合材料的体外降解曲线逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－７邋Ｔｈｅ邋ｖｉｔｒｏ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ邋ａｎｄ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ邋ｍａｔｅｒｉａｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ逡逑ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ邋ｃｏｎｔｅｎｔ．逡逑２．７体外降解液中钙离子、槲皮素浓度测定逡逑不同含槲皮素浓度的复合材料体外降解液中的钙离子与槲皮素含量变化如逡逑图１－８所示。第一周，ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ组和０．５％Ｑ－ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ组降解液中的Ｃａ２＋逡逑浓度较１．５％及３％复合材料组中的Ｃａ２＋浓度偏高，差异有统计学意义（Ｐ＜0．0５），逡逑前者两组间比较差异无意义，后者两组间比较同样无明显统计学意义。而后，时逡逑间进入第二周直至第八周，四个浓度组的复合材料体外降解液中钙离子浓度差逡逑异不大。所有实验组，，第二周至第四周，钙离子浓度曲线下降明显；第五周开始逡逑钙离子浓度趋于稳定，进入平台期，而四组材料的钙离子浓度曲线也基本呈现重逡逑１９逡逑

ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ邋组介于中间；而邋７２ｈ邋时，０．５％Ｑ－ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ邋组组最低，ａ－ＣＳＨ／ｎ－逡逑ＨＡ和３％Ｑ－ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ组介于中间，各个实验组间比较，差异均没有明显统逡逑计学意义（Ｐ＞0．0５，详见表２－６和图２－２所示）。不同浓度Ｑ－ａ－ＣＳＨ／ｎ－ＨＡ复合逡逑材料浸提液对大鼠骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣｓ）的细胞毒性均为Ｉ级，即无细逡逑胞毒性。逡逑４１逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08;R68

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本文编号：2592395