基于移动反应界面电泳滴定的便携式碱性磷酸酶活性检测方法和装置

发布时间：2020-03-21 03:51

【摘要】：作为有机体中一种广泛分布的非特异性磷酸单酯酶,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)催化多种底物(如核酸、蛋白质和生物碱等)去磷酸化,对多种疾病的诊断具有重要的临床意义。常见的ALP活性检测方法有比色法、电化学发光法、化学发光法和荧光法等。这些检测方法一般基于仪器设备(如分光光度计、电化学传感器、荧光光度计),具有稳定、灵敏、自动化、高通量等优点。但这些方法需要专用检测器、仪器体积庞大、设备昂贵,更无法实现便携式现场检测。针对现有技术存在的问题,本文的具体研究内容如下:1.碱性磷酸酶催化介导的电泳滴定理论与装置基于移动反应界面电泳滴定(electrophoresis titration,ET)理论,提出了一种检测ALP活性的新原理、新装置与新方法。其原理主要在于,阴极孔中的ALP在碱性环境中能将4-甲基伞形酮磷酸酯二钠盐(4-MUP)水解成带有负电荷的4-甲基伞形酮([4-MU]~-)。[4-MU]~-在紫外激发下能发出强烈的蓝色荧光,在电场作用下向阳极移动,并与芯片通道中的酸性离子发生中和反应,形成荧光移动反应界面(moving reaction boundary,MRB)。该MRB的移动速度(V_(MRB))与ALP活性成正比,因而可通过测量V_(MRB)得到相应ALP活性。该ALP-ET方法所需装置十分简单便携,仅由LED紫外灯、PMMA芯片、铂电极和锂电池组成。2.碱性磷酸酶催化介导的电泳滴定理论的验证为证明碱性磷酸酶催化介导的电泳滴定理论的合理性与可行性,开展了一系列相关实验进行验证。实验结果表明,阴极孔中ALP催化产物[4-MU]~-在电场作用下进入芯片微通道,并与通道中的H~+发生中和反应,形成移动中和反应界面。而且随着ALP活性增加,V_(MRB)也随之加快。通过检测不同活性ALP所对应V_(MRB),得到了ALP活性与MRB移动速率之间的标准曲线:V_(MRB)=0.033A+3.87,R~2=0.9980,线性关系良好,其线性范围为1.0-10.0 U/L。该方法灵敏度高(检测限可达0.1 U/L),具有良好的选择性,且精确度高(RSD值为2.7~6.8%,回收率为101~105%)。此外,还对ALP-ET装置的关键部件锂电池的稳定性进行了相关研究。当锂电池持续工作超过12小时,其电压仍可以维持在初始电压的98%以上,也即只有不到2%的电压衰减;当180个通道同时运行时,锂电池的电压仍可维持在初始电压98%以上至少60min。3.碱性磷酸酶催化介导的电泳滴定理论的应用将该ALP-ET方法应用于实际血清样本ALP活性检测,以评估其应用于临床诊断的可能性。并与临床所用检测方法相比较,统计学分析结果表明该两种方法的检测结果之间无显著性差异。该方法检测结果的可信度较高,而且能区分肝病患者和正常人。正钒酸钠作为一种常见的ALP抑制剂,在多种人类癌细胞(包括肺癌,肾癌和前列腺癌)中表现出了抗肿瘤活性,因而本文也提供了基于ALP-ET理论的正钒酸钠的检测方法。结果显示,随着ALP抑制剂浓度的增加,MRB移动速率随之降低,呈现负相关的线性关系。其标准曲线为:V_(MRB)=-0.0159 C_(in)+1.9418(R2=0.9933),检测限可达0.1Μm。本文提出的ALP-ET理论为正矾酸钠浓度检测、抗癌药物的设计提供了新思路和新方法。
【图文】：

示意图,示意图,电泳,芯片

图 2-1 ALP-ET 方法原理示意图。（A）ALP 将 4-MUP 水解为[4-MU]-；（B）在电泳滴定时间为 t0、t1和 t2时，，MRB 的移动情况。“+”和“-”分别表示离子所带正电荷和负电荷。Fig. 2-1 Schematic illustration of ALP-ET chip model for measurement of ALPactivity via moving reaction boundary (MRB). (A) ALP-induced enzymaticcatalysisof 4-MUPto[4-MU]-; (B)Run ofETchipatrunningtime (t0)justbeforethe start of ET, (t1) and (t2). The symbols of “+” and “-” imply the anode and thecathode, respectively. Other symbols see the figure and context.2.3 ALP-ET 芯片装置2.3.1 ALP-ET 芯片设计ET 微流控芯片作为 ALP 酶催化反应、电泳滴定的操作和发生平台，是本实验的关键部件之一。ALP-ET 芯片通过 AutoCAD 2016 (Autodesk Inc., USA)软件进

芯片,材质

上海交通大学硕士学位论文芯片采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材质，该材质易于加工，具有良好化学稳定性、透光性和密封性。芯片的加工主要包括清洗、甩胶、曝光、显影、胶、脱模、键合等步骤。芯片的主结构使用 CNC 线切割机器生产，微通道采用压成型方法加工而成。每个芯片可同时运行 3 个电泳滴定，以用于平行对照实验
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O652;R318

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