新型PLA-PEG-RPM生物可降解血管支架制备及生物相容性研究

发布时间：2020-03-26 20:51

【摘要】：目的:用3D打印技术制备一种新型PLA-PEG-RPM(聚乳酸-聚乙二醇-雷帕霉素)生物可降解血管支架并评估其生物相容性,为生物可降解支架的后续动物实验?临床试验研究提供研究基础。方法:通过3D max软件对血管支架进行建模,导出为光固化立体造型术(Stereolithograp Hy,STL)格式。使用双螺杆挤出机将不同配比的聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)、雷帕霉素(Rapamycin,RPM)挤出造粒。材料粒子经3D打印拉丝机拉丝得到3D打印线料。使用熔融沉积造型技术(Fused Deposition Modeling,FDM)打印出支架。使用压力泵和球囊测量支架发生断裂时的扩张压力,以评估各组支架的韧性并找出韧性最佳的支架组。对该组支架的降解情况进行长期观察,测量支架降解后质量和浸提液的p H变化。用傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform infrared spectroscopy,FITC)鉴定支架所含物质的结构和分析支架所含物质的官能团。用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)分析支架中所含药物雷帕霉素的情况,并探究经过3D打印后支架中聚合物的熔融行为是否有所改变。提取猪的骨髓干细胞,诱导分化成血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,并用α-actin(α-平滑肌肌动蛋白)和v WF(第Ⅷ因子相关抗原)分别鉴定。用制备的各组支架分别与血管平滑肌细胞和血管内皮细胞进行共同培养,观察细胞在支架上的分布情况。各组支架分别与血管平滑肌细胞和血管内皮细胞进行共同培养8天,隔天利用MTT法分析支架上的活细胞量,再根据国家安全性标准规定的毒性标准对各组结果进行分级,评估细胞在各组支架上的活性。通过支架材料与冠脉内皮细胞的共培养,以细胞计数的方式计算不同材料表面细胞粘附的数量和悬浮细胞数量,评估支架材料是否有利于细胞的粘附与生长。通过检测OD值间接测量血红蛋白释放量,观察各组支架的溶血率,以评估支架的血液相容性。用富含血小板的血浆接触材料30min,在扫描电镜下观察各组支架上的血小板粘附数量,以评估支架抗血小板的能力。结果:1.测得韧性最佳的PLA-PEG混合物质量比例为90%。2.含有PEG的样品短期内质量下降明显。单纯PLA支架降解速度最快,PLAPEG-RPM支架降解速度次之,最慢的是雷帕霉素涂层PLA-PEG支架。(P0.05)3.FITC实验证明经过3D打印处理,PEG对PLA的结构和官能团有影响。PLAPEG-RPM支架保留了雷帕霉素的固有结构和官能团。4.DSC分析显示PLA的熔融温度因PEG的添加而降低,PEG改善了聚乳酸的热稳定性。RPM经过3D打印处理后依然保留其熔融峰。5.内皮细胞在PLA支架、PLA-PEG支架、PLA-PEG-RPM支架上均分布均匀且密集,生长状态良好,平滑肌细胞的细胞在PLA、PLA-PEG支架表面贴壁生长且覆盖支架表面,分布均匀,生长良好,在PLA-PEG-RPM支架上细胞数量减少,分布欠均匀。6.在分别培养2、4、6、8天后,各组支架浸提液中生长的内皮细胞和平滑肌细胞的细胞毒性级别都在0.9和1.3之间。7.PLA支架组、PLA-PEG-RPM支架组和对照组黏附细胞个数分别为(36.675±9.98)×104个、(35.25±7.14)×104个、(34.00±10.68)×104个,未黏附细胞个数分别为(2.74±0.40)×104个、(2.50±2.38)×104个、(4.1±1.85)×104个,细胞黏附率分别为93.05%、93.38%、89.24%。(P0.05)8.PLA-PEG支架组溶血率HR为4.132%。PLA-PEG-RPM支架组溶血率HR为2.686%。9.PLA-PEG支架、PLA-PEG-RPM支架表面血小板均匀分布,有部分血小板发生聚集现象。结论:1.适量的PEG能帮助PLA克服脆性。雷帕霉素涂层能延缓聚乳酸降解过程。含有PEG的支架短期内质量下降较快。经过3D打印处理,PEG对PLA的结构和官能团有影响。经过3D打印处理,雷帕霉素保留固有结构、官能团和熔融峰。3D打印技术制备PLA-PEG-RPM支架具有可行性。2.PLA-PEG-RPM支架的内皮细胞和平滑肌细胞毒性级别分别在国家安全标准允许的范围内。PLA-PEG-RPM支架对细胞黏附能力没有较大影响,PLAPEG-RPM支架不会影响内皮化。血小板吸附试验证明PLA-PEG-RPM支架对血小板的分布和聚集没有显著影响。PLA-PEG-RPM支架生物相容性良好,可用于体内实验。
【图文】：

血管支架

3.1 3D 打印支架材料的设计3.1.1 3D 打印技术的选择熔融沉积造型技术(Fused Deposition Modeling,FDM)由 CrumpS 在 1988 发明,具有操作简单、打印速度快等优势。因此,在实际应用中,FDM 技术逐渐为了 3D 打印技术中最常见的技术[54]。FDM 工作原理是将已经提前由拉丝机加工成线的材料,抽送至热熔喷头。头内温度由加热组件和温控设备共同控制,略微高于材料的熔点。喷头由电脑制,按照电脑内软件预定的轨迹运动,与此同时线性材料加热成熔融液体状态,着喷嘴运动轨迹流出。材料自喷嘴挤出后,在室温下逐渐冷却并凝固,最终堆叠电脑软件建模所设计的模样。3D打印设备的零件组成和工作原理如图 3-1所示

聚乳酸,材料,支架,样品

东南大学硕士学位论文体。它对材料的物理性能和熔点有严格的限制,制约了能使用的材料种类。3.1.2 3D 打印材料——聚乳酸的改性传统 FDM3D 打印技术只使用单一材料制成的线材进行 3d 打印,但是面对日益增长的复合材料需求,很多情况下,单一的材料所具有的特性并不能满足需要。聚乳酸是目前常见的 3D 打印生物材料,虽然具有杰出的生物降解性能,但因为其材料本身存在脆性大、塑形难等缺点,限制了聚乳酸在医学 3D 打印中的运用。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543;R318.08

【参考文献】