结合物理引导及生化信号的聚酯材料用于周围神经组织再生的研究

发布时间：2020-03-27 05:08

【摘要】：全世界每年数百万人遭受周围神经系统损伤,不仅生活质量严重下降,还背负沉重的经济负担。当周围神经系统受到较大损伤(通常5 mm)时,不能实现自我重建与修复。目前,包括自体移植和人工合成神经导管都存在神经桥接不匹配、功能难以恢复等缺点。雪旺细胞是周围神经纤维的髓鞘细胞,规整有序的排列形成髓鞘膜并包裹神经纤维。模拟生物体内的物理和化学信号,引导雪旺细胞定向迁移,可以加快神经的再生,促进功能的恢复。首先合成了带有马来酰亚胺活性侧基的聚合物P(LLA-MTMC),利用PDMS模板在此聚合物表面引入了 20/20 μm、20/40 μm的嵴-沟槽条带状微图案,并通过马来酰亚胺与巯基的点击反应修饰了多肽CQAASIKVAV。雪旺细胞在多肽修饰的20/40 μm条带薄膜上具有更早的取向、更大的长径比、更好的定向迁移效果、更长的迁移净距离,而且,保持原有的生物功能。PC12细胞在多肽修饰的条带化薄膜表面分化出更多更长的轴突。通过粘附力、黏着斑、细胞骨架、细胞核染色及粘附相关基因(NCAD、NCAN、PO)的表达进一步研究了细胞与材料的作用机理。针对聚酯材料难以改性,利用一种简单的技术方法在条带化聚酯薄膜表面固定生物大分子明胶。首先制备PLCL聚合物薄膜,通过PDMS模板热压法在其表面分别引入沟槽-嵴宽度为3/3 μm、10/10μm。利用溶胀-截留法成功在条带化PLCL薄膜表面固定了明胶。雪旺细胞在高密度明胶的条带化薄膜表面取向较好,特别是明胶密度较高的3/3 μm PLCL薄膜表面具有较大的长径比和定向迁移能力。通过粘附力、黏着斑、细胞骨架、细胞核染色及粘附相关基因的表达(integrinβi、Racl、RhoA、Cdc42)进一步研究了细胞与材料的作用机理。雪旺细胞在周围神经系统损伤后会形成“Bunger”带,并集群迁移,利用细胞球模拟雪旺细胞形成“Buunger”带过程,考察材料表面拓扑形貌和化学信号对雪旺细胞球及集群迁移的影响。通过溶液浇筑法制备了 PLCL薄膜,利用带有不同尺寸微图案的PDMS模板热压在PLCL表面引入沟槽-嵴条带,对条带化PLCL胺解后,通过静电作用在材料表面吸附纳米级氧化石墨烯片。氧化石墨烯修饰的条带化PLCL薄膜可以显著促进细胞的伸长、取向、定向迁移、伤口愈合及细胞从球体中的迁出。尺寸越小效果越显著。雪旺细胞在3/3-PLCL/GO film表面具有最大的伸长细胞百分比、长径比,取向最好,单细胞的定向迁移速度最大、距离最远。雪旺细胞在3/3-PLCL/GOfilm表面的伤口愈合效果最显著,达75%,细胞从球体迁出的距离最大为678μm。在本文中,通过模拟生物体周围神经组织的结构,在材料表面构建物理条带,同时结合生物活性分子,有效地调控雪旺细胞的取向、伸长、单细胞迁移和细胞集群迁移,并初步揭示了其作用机理,为带有取向结构如肌腱、尿道、神经等组织工程材料的制备和设计提供了新思路。
【图文】：

截面图,周围神经,截面图,轴突

神经轴突再生速度大约为２－５邋ｍｍ／天，对于较严重的神经损伤常常会造成终身残逡逑疾［３］。在周围神经系统中主要肢质细胞为雪旺细胞（Ｓｃｈｗａｎｎ邋ｃｅｌｌ），雪旺细胞逡逑形成髓鞘膜包裹着神经轴突取向排列［４］（图１．１）。逡逑？邋？逦Ｅｐｉｎｅｕｒｉｕｍ逦．逡逑Ｐｅｎｎｅｕｎｕｍ逦／＼逦＾逡逑Ｅｎｄｏｎｅｕｒｉｕｍ邋＼逦／／逡逑Ｓｃｈｗａｎｎ邋ｃｅｌｌ邋Ｎｏｄｅ邋ｏｆ邋Ｒａｎｖｉｅｒ逡逑１逦ＭｙｅＤｎ邋ｓｈｅａｔｈ逡逑一逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｉ．ｌ邋Ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ邋ａｎａｔｏｍｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ邋ｎｅｒｖｅ．邋Ｉｎｓｅｔ邋ａｔ邋ｌｅｆｔ邋ｓｈｏｗｓ邋ａｎ邋ｕｎｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ逡逑ｆｉｂｅｒ．邋Ｉｎｓｅｔ邋ａｔ邋ｂｏｔｔｏｍ邋ｓｈｏｗｓ邋ａ邋ｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ邋ｆｉｂｅｒ邋［４］．逡逑图１．］周围神经纤维的截面图［４］。逡逑周围神经损伤后会发生一系列分子、细胞水平的变化，神经断端远侧的轴突逡逑会触发瓦勒氏变性，导致神经丝和轴突徵管的崩解、碎裂［５］（图１．２）。抻经损逡逑伤２４邋ｈ内断端的远侧轴突溃变为颖粒状无固定形态的碎片；４８邋ｈ内，神经纤维逡逑外层的髓鞘膜开始崩解并产生一些短的片段［６］。在此过程中，巨噬细胞和单核逡逑细狍迁移和聚集到损伤部位，清除崩解的髓鞘和轴突碎片［７］。同时，雪旺细胞逡逑发生增殖，，形成纵向排列的有利于轴突再生的ＢＵｎｇｎｅｒ带［８］；分ｉ必各种利于神经逡逑再生的活性因子如神经生长因子（ｎｅｒｖｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ

微结构,硬度

了不同微结构和强度的三维明胶支架，发现微结构和硬度影响骨髓间充实干细胞逡逑向雪旺细胞分化；具有取向通道结构、硬度为４０ＭＰａ的支架材料促进分化成雪逡逑旺细胞的作用最强［２９］（图１．５）。透明质酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ，ＨＡ）又称为玻尿逡逑酸，是由０（１４）－Ｄ－葡萄糖醛酸和０（ｌ－３）－Ｎ－乙酰－Ｄ－葡糖胺的双糖单位反复交替逡逑连接而成的酸性黏多糖，广泛存在于细胞外基质中。逡逑４逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ317;R318.08

【参考文献】