脂肪来源间充质干细胞外囊泡行钛材料表面改性促进骨再生的相关研究

发布时间：2020-03-27 06:24

【摘要】：目的:1.检验h ADSC-EV是否能够促进成骨分化;2.探索将MSC-EV用于Ti材料表面改性的可行性;3.研发一种适用于金属植入物表面锚定MSC-EV的方式;4.检验经h ADSC-EV表面活化改性的Ti材料是否具备更好的促进骨再生能力,为临床医用金属植入物的表面改性提供新的思路。方法:1.采用超速离心法制备h ADSC-EV,并通过SEM、颗粒跟踪分析、Western-blot等方式对其进行鉴定;以人成骨样细胞MG63为对象,通过茜素红染色与钙定量检测等方式检验h ASC-EV是否具备促进成骨分化的作用;通过基因芯片以及生物信息学分析等手段对h ASC-EV中可能发挥生物学效应的物质进行初步筛选。2.应用恒电位法制备Bio-Ppy-Ti(生物素-聚吡咯-钛),设置实验分组:Ti、Ppy-Ti、Bio-Ppy-Ti,通过SEM、AFM、荧光显像等手段对各组材料的表面形貌、粗糙度以及生物素负载量进行表征;将生物素修饰的h ADSC-EV孵育到Bio-Ppy-Ti表面,通过共聚焦观察比较第0天、第7天与第14天材料表面的EV残留量,检测锚定的长效性;将生物素修饰的h ADSC-EV分别孵育到各组材料表面后进行超声震荡处理,通过SEM以及共聚焦显微镜观察各材料表面EV的残留量,检测锚定的稳定性。3.设置实验分组:Ti、Bio-Ppy-Ti、EV-Bio-Ppy-Ti,在不同材料表面接种人成骨样细胞MG63,通过F-actin染色比较早期不同时间点(6h、12h、24h)的细胞形态以及黏附情况;培养14天后,通过q RT-PCR与免疫荧光观察细胞在不同材料表面培养后成骨相关基因(ALP、COL1、OCN)与蛋白(COL1、OCN)的表达;在不同材料表面接种人成骨样细胞MG63并培养14天,随后埋植裸鼠(Balb/c,雌性,8-9周龄)皮下,一个月后对局部组织进行HE及免疫组化分析。结果:1.添加10μg/m L h ADSC-EV培养MG63细胞14天后,细胞内外总钙含量为1.1855±0.1860 mmol/L,而空白对照组为0.1418±0.0120 mmol/L,阴性对照组(h DFEV)为0.1729±0.0370 mmol/L,其中h ADSC-EV组的钙含量相对于空白对照组与阴性对照组显著提高。进一步在表达量前30位的h ADSC-EV mi RNA中筛选到5种可以调控成骨分化的mi RNA。2.通过电化学聚合法可成功在Ti表面聚合Bio-Ppy涂层,电化学聚合条件为1.5V、120s时,Bio-Ppy-Ti表面的生物素掺杂量最多;生物素化的h ADSC-EV在Bio-Ppy-Ti表面孵育7天与14天后,EV的残留量分别为初始状态的96.17%与94.67%;生物素化的h ADSC-EV孵育到各组材料进行超声震荡处理30s后,Ti、Ppy-Ti与Bio-Ppy-Ti表面的EV残留量分别为初始状态的0.34%、0.67%与62.74%,其中Bio-Ppy-Ti组显著高于Ti组与Ppy-Ti组。3.在不同材料表面接种MG63细胞培养6小时后,Ti、Bio-Ppy-Ti与EV-Bio-Ppy-Ti表面的细胞投影面积分别是946.42±69.32μm2、841.69±147.98μm2与1361.26±163.14μm2,其中Bio-Ppy-Ti组显著高于Ti组与Ppy-Ti组;在不同材料表面接种MG63细胞培养14天后,EV-Bio-Ppy-Ti组中细胞的ALP基因、COL1基因与OCN基因的表达量分别为Ti组的1.27倍、1.68倍与1.82倍,其差异具有统计学意义;不同材料经裸鼠皮下植入一个月后,EV-Bio-Ppy-Ti组的皮下组织中可见少量散在分布的OCN阳性细胞,而Ti组与Bio-Ppy-Ti组的皮下组织内未见OCN阳性表达的细胞。结论:1.h ADSC-EV可以在体外促进成骨样细胞MG63的成骨分化;h ADSC-EV中富含多种可以调控成骨分化的mi RNA。2.通过恒电位法可在Ti表面制备出Bio-Ppy涂层,在1.5V、120s聚合条件下生物素的掺杂含量最多;h ADSC-EV能通过ABC法在Bio-Ppy-Ti表面长期负载达14天;h ADSCEV能通过ABC法在Bio-Ppy-Ti表面稳定负载,至超声震荡300s后才全部脱落。3.经h ADSC-EV修饰的Ti材料能够促进成骨细胞的早期黏附与伸展;同时,经h ADSC-EV修饰的Ti材料能够在体内与体外促进成骨细胞中成骨相关基因与蛋白的表达。
【图文】：

均值比较,共表达,单因素方差分析,学分

选统计学显著性。5）miRNA-mRNA 共表达网络由 WGCNA 构建，miRNA 和 mRNA 之间的相关筛选阈值为大于 0.8。2.5 统计分析实验数据用均数±标准差表示。两个组间的均值比较使用 Student’s-t 检验，多组间的均值比较使用单因素方差分析（One Way ANOVA）以及 Newman-Keuls 检验以 p< 0.05 表示数据有统计学差异。所有数据均使用 GraphPad Prism5 软件进行统学分析。3. 实验结果3.1 hADSC 的观察与鉴定

透射电镜,脂质,标志物,茶托

研究所提取的 hADSC 阳性表达间充质干细胞标志物 CD90 与 CD105，以及细胞粘分子 CD29、CD44，同时阴性表达造血细胞标志物 CD45。3.2 hADSC-EV 的观察与鉴定通过扫描电镜与透射电镜对 hADSC-EV 的形态进行观察，在扫描电镜下可hADSC-EV 呈较为均一的球形颗粒（图 2.A），直径均在 1μm 以下；透射电镜下可察到由脂质双分子层形成的茶托样结构（图 2.B）。同时，hADSC-EV 可被脂质特异燃料 PKH26 染色（图 C）。以上结果说明，所提取的 hADSC-EV 是具有纳米级别的形脂质颗粒。通过蛋白免疫印迹法在 hADSC-EV 内检测到了其特异性的跨膜蛋白族 CD9 与 CD81 的表达（图 2.D）。由于仅通过电镜下的形态观察还不足以对 hADSEV 的粒径进行精确分析，因此，我们采用纳米颗粒跟踪分析仪对 hADSC-EV 进行相应的分析，发现其直径范围在 100nm-800nm，主要集中于 174nm（图 2.E）。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08

【相似文献】