基于海藻酸牺牲材料构建微脉管系统及其用于肝组织工程的研究

发布时间：2020-04-03 12:30

【摘要】：随着组织工程技术的发展,利用肝细胞和生物材料体外构建类肝组织体为肝脏疾病的治疗带来了希望。但是,在目前肝组织工程的研究中,仍然存在着两个主要问题,一个是肝细胞体外培养中的极性丢失问题,另一个是物质传递限制导致的细胞坏死问题。本研究根据肝窦的结构特征,以肝实质细胞、血管内皮细胞和凝胶基质材料为基本元素,构建一个体外类肝组织体,探索解决肝组织工程领域的核心问题。具体来说,我们以海藻酸凝胶作为牺牲材料,通过对其进行微加工成型、表面修饰、包埋、去凝胶化等过程操作,构建一个基于凝胶基质的微流控通道系统。在微流控通道内种植人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),经过三维培养,形成一个近似于体内血管壁的内皮细胞层。在此基础上,将肝实质细胞装载到外围凝胶基质中,形成一个结构有序的共培养体系,研究该体系对物质传递和肝细胞功能的影响。具体研究内容如下:(1)构建一个基于海藻酸牺牲材料的微通道体系。首先通过流体纺丝法制备海藻酸微型柱状凝胶,考察二价阳离子、针头内径和流体流速对海藻酸凝胶形貌及力学性能的影响规律。研究发现,使用Ca~(2+)作为交联因子,流体流速范围控制在60-180μL/s的范围,所制备的柱状凝胶直径与打印针头内径成正相关。然后将该微型柱状凝胶包埋在外围基质中,考察外围基质的组分对其力学稳定性及生物性能的影响。最后,以柠檬酸钠溶液作为液化剂,将包埋于外围基质体系中的海藻酸凝胶液化后形成微通道。通过考察体系中微通道的结构及性能,筛选出一个快速有效且生物相容的去凝胶化方法。(2)微脉管系统的构建。首先使用壳聚糖(CS)修饰海藻酸钙凝胶,在其表面形成一层复合膜结构。考察了壳聚糖与海藻酸钙凝胶反应时间对复合膜结构及生物性能的影响。反应时间为3-7 min时,可形成5μm-15μm厚度的壳聚糖膜。在修饰后的海藻酸钙凝胶表面接种HUVECs,培养9天后,形成致密细胞层。经细胞增殖、凋亡分析,具有复合膜的海藻酸钙凝胶(CS/Ca-Alg)可促进细胞增殖,抑制细胞的凋亡。之后将铺满内皮细胞的CS/Ca-Alg包埋于三维复合凝胶中,使用柠檬酸钠溶液溶解并形成微脉管结构。考察柠檬酸钠溶液浓度对凝胶完全液化时间及细胞活性的影响,结果显示15 mM的柠檬酸钠可在20-40 min内将直径为500-1000μm的海藻酸钙凝胶完全液化,且可保持细胞活性在80%以上。最后,我们分别对通道内物质的传递做了评价,发现具有膜结构的微流控通道及脉管系统都可以选择性的透过分子。(3)体外构建具有脉管系统的类肝组织体。在上述研究工作的基础上,以人肝癌细胞系(HepG2)为模型,利用该脉管系统组建了一个结构有序的共培养体系。一方面,该脉管系统作为营养物质的传输系统,为三维体系中的肝细胞代谢提供足够的营养物质,因此解决了仅依靠扩散效应而形成的物质传递限制问题。另一方面,该脉管系统作为有序共培养体系的架构,为肝细胞极性重建和功能修复提供了一个微环境。研究发现,包埋在脉管系统中的肝细胞活性显著增强,肝细胞特定功能的表达,包括白蛋白的分泌以及肝细胞特定基因的表达水平得到了显著改善。与异物代谢相关的基因CYP1A1、CYP3A4、UGT1A1与GSTA1表达水平分别增加了3.5倍、11.1倍、7.9倍、5.6倍。与合成相关的转录因子NDUFA3与GCLM分别增加了2.0、4.2倍。培养5天后,在脉管系统中内皮细胞的影响下,肝细胞白蛋白的分泌量增加了2.8倍。综上所述,本研究提出一种构建微通道和微脉管系统的方法,该脉管结构作为物质传递系统能够为组织体中的细胞提供丰富的营养物质。更重要的是,它可作为一个有序的共培养体系,为肝细胞极性重建和功能修复提供了一个良好的微环境,为探索肝组织工程的研究提供一个新思路。
【图文】：

共培养,细胞

图 1-1 细胞 A 与细胞 B 直接共培养Fig 1-1 The direct co-culture of the A cell and B cell触共培养体系触共培养体系，即将两种或两种以上的细胞分别接种于不种载体置于同一培养环境之中，使不同种类的细胞共用同接触[58]。主要有条件培养基共培养法、“爬片式”共培养法（Transwell 小室）等[59-62]。养基是用培养过一种细胞的培养基培养另一种细胞，两种胞因子可以交流，其优点是可以消除目的细胞对条件细胞对目的细胞的作用[63]。此法简便易行，但是时间上的不统严格来说，这种方法介于单层细胞培养和共培养之间，是

结构示意图,共培养,细胞

太原理工大学博士研究生学位论文的共培养体系[65]。Transwell 小室底部的膜将上下层细胞分开，膜0μm，一般为 0.4μm，细胞不能自由通过此膜，但细胞因子可以自通过此膜进行信息交流。嵌入式细胞共培养法是目前应用最多的共培养法可用于各种生长状态的细胞，其优点是便于分离 2 种细察其各自的细胞状态变化，以探讨一种细胞对另一种细胞的作用。ranswell 小室共培养处理过的内皮细胞和上皮细胞，探讨了多壁碳在心血管疾病中的作用。张明[67]通过分离、培养人纤维环（AF）细分别吸取第 3 代 AF 细胞和 BMSCs，按 1：1 比例分别植于 Tra养系统中，，下室植入 BMSCs，上室植入 AF 细胞，以建立 2 种细胞型，从而探讨了共培养体系对 AF 细胞增殖和细胞外基质合成的影Cs 是否具有向 AF 细胞分化的能力。
【学位授予单位】：太原理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08

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