富含nHA并缓释NELL-1蛋白的纳米纤维支架构建及其体外生物活性研究

发布时间：2020-04-15 10:18

【摘要】：背景和目的:近年来,骨组织工程因组织来源丰富、无继发感染等独特优势从而成为骨缺损治疗的研究热点。支架是骨组织工程的重要组成因素之一,骨再生所需工程支架材料需具有三维多孔互联结构、良好生物相容性及可降解性、可有效负载及持续释放生长因子、良好骨传导性和骨诱导性等重要特性。故目前在骨组织工程研究中如何构建符合上述原则的支架材料是研究的热点,其中赋予支架材料良好的成骨活性(骨诱导性和骨传导性)是骨组织工程支架设计的难点和重点。聚己内酯是一种有机高分子材料,用其制备的静电纺丝纳米纤维支架具有良好的生物相容性及机械强度、多孔互联结构及高效的比表面积并可负载多种生长因子等特性,可较好模拟骨组织天然的细胞外基质结构。然而其弱亲水性、降解产物的酸性等特性限制了其使用。而纳米羟基磷灰石(Nano-hydroxyapatite,nHA)是骨基质的主要无机成分,与黏附蛋白有很好的亲和力并在成骨细胞的分化、矿化中发挥重要作用,同时其偏碱性的特性可有效中和有机聚合物降解过程中的产酸,使其成为充当骨传导性的理想材料,然而其机械强度较低易碎限制了其应用。近来研究表明,通过相分离、静电纺等技术将纳米羟基磷灰石等生物陶瓷与有机高分子材料结合,形成含有纳米级生物陶瓷的聚合物复合材料,可较好的发挥陶瓷材料与高分子材料的优点。骨组织再生是新骨形成的过程,需要多种生长因子的参与,其中尼尔样1型分子(Nel-like molecule 1,NELL-1)是新发现的促进骨形成的生长因子,参与成骨细胞的募集、增殖、分化、矿化及细胞与细胞间质的相互作用。NELL-1处于Cbfa1/Runx2的下游,与BMP-2相比,其不存在异位成骨,且其诱导形成的骨质更致密。骨组织工程设计的目标是实现细胞外基质微环境体系和骨生化信号分子体系重建与再生,以快速实现骨组织再生。基于以上认识,本研究分三个部分构建具有生物活性的支架材料。第一部分首先通过去溶剂法制备负载NELL-1的BSA凝聚体,再将壳聚糖通过静电吸附作用包被及稳定BSA凝聚体形成壳聚糖纳米微球,形成生长因子释放的第一层屏障。第二部分采用静电纺丝技术将不同质量的纳米羟基磷灰石与PCL制备成含有纳米级生物陶瓷的聚合物纳米复合材料,以期结合二者的优点为骨缺损修复提供新的具有骨传导性的支架材料。第三部分经静电纺丝技术将壳聚糖微球及nHA嵌入聚己内酯聚合物纤维支架,形成生长因子释放的双层保护屏障,并赋予纳米纤维支架骨传导性和骨诱导性,进而构建符合骨组织再生所需的仿生微环境,以期为骨缺损的修复提供新的支架材料和生长因子载药和释放方式,为骨缺损修复提供新的研究思路。本研究的目的如下:(1)构建负载NELL-1蛋白的纳米微球,形成生长因子释放的第一层屏障,检测微球的材料表征、生长因子体外释放及体外生物活性。(2)制备富含纳米羟基磷灰石的PCL复合纤维支架材料,赋予材料骨传导性,检测和评价不同nHA含量的复合支架材料的理化表征、生物相容性并探讨复合支架材料对MC3T3-E1前体成骨细胞黏附、增殖、分化及成骨相关基因(RUNX2、OPN、COL1)表达的影响。(3)构建富含纳米羟基磷灰石并缓释NELL-1蛋白的复合纤维支架材料,形成生长因子释放的双层保护屏障,赋予纳米纤维支架骨传导性和骨诱导性,评价支架材料的理化表征及生物相容性,并检测复合支架材料中NELL-1蛋白的缓释效果,探讨复合支架材料对MC3T3-E1前体成骨细胞黏附生长、增殖、分化及成骨相关基因(RUNX2、OPN、COL1)表达的影响。材料与方法:(1)首先采用去溶剂法及自组装技术制备负载NELL-1的壳聚糖纳米微球(Chi/NNPs),采用透射电镜、纳米粒度仪、ART-FTIR、CLSM检测微球的材料表征,用NELL-1 Elisa Kit检测微球的包封率及体外蛋白释放,通过检测小鼠成骨细胞碱性磷酸酶表达评价释放NELL-1的生物活性。(2)采用静电纺丝技术将不同质量的纳米羟基磷灰石与PCL制备成复合纤维支架材料,通过SEM、TEM、拉伸强度检测、ART-FTIR、接触角仪及亲水率检测等评价复合支架材料的表征,用CCK-8试剂盒及CLSM检测评价支架材料上MC3T3-E1粘附生长及材料毒性情况,采用茜素红染色、ALP试剂盒及RT-PCR检测不同复合支架材料对MC3T3-E1细胞成骨向分化、矿化的影响。(3)采用静电纺丝技术将Chi/NNPs及nHA嵌入聚己内酯复合纤维支架,通过SEM、TEM、拉伸强度检测、接触角仪及亲水率检测评估材料的表征,NELL-1 Elisa Kit检测复合支架材料体外释放NELL-1的缓释效果,采用CCK-8试剂盒、CLSM、SEM检测评估MC3T3-E1细胞在复合材料粘附生长、粘附伸展及材料的毒性情况,采用ALP试剂盒及RT-PCR评价不同复合支架材料对MC3T3-E1细胞成骨向分化、矿化的影响。结果:(1)第一部分实验:TEM结果显示,Chi/NNPs与Chi/BNPs可形成纳米微球结构,表面具有明显的被壳聚糖包被的图像,形态稳定,呈球形、光滑、无团聚。ART-FTIR显示壳聚糖、BSA蛋白的光谱特征峰可以在壳聚糖纳米微球的光谱中观察到。CLSM镜下可见壳聚糖包被的纳米颗粒均匀分散在玻璃片上,没有明显的团聚,绿色荧光颜色在纳米颗粒上的均匀分布表明壳聚糖在BSA颗粒上均匀分布。粒径结果显示Chi/BNPs 粒径为 378.726 ±13.140nm、Chi/NNPs(0.075%、0.15%、0.3%)粒径分别为 368.663±15.470nm、382.881 ± 18.767nm、390.480±11.465nm,这四组的粒径无差异但均比BSA凝聚体的直径大,且有统计学意义(P0.05)。Chi/BNPs各组的 PDI 值为 0.378±0.029、Chi/NNPs(0.075%、0.15%、0.3%)组分别为0.379±0.017、0.388±0.039、0.462±0.030,均小于 0.5,而 BNPs 的 PDI 值为 0.669±0.072。Chi/NNPs(0.075%、0.15%、0.3%)的 zeta 电位分别+25.03±1.42mV、+30.27±1.80mV、+31.03±2.05mV,Chi/BNPs 及 BNPs 的 zeta电位为+29.03.03±2.15mV、+23.067±2.54mV。Chi/NNPs(0.075%、0.15%、0.3%)包封率分别为88.50±3.63%、89.30±3.82%、87.83±3.50%,组间比较差异无统计学意义(P0.05)。体外累计释放曲线显示NELL-1可以持续释放192h以上,释放初期突释不明显,在0.15%壳聚糖组和0.3%壳聚糖组之间存在相似的释放曲线,两者之间差异无统计学意义。与新鲜NELL-1溶液相比,从Chi/NNPs(0.15%)0～2d 释放的 NELL-1 的 ALP 活性分别为 93.18±8.99%、3～5d为85.35±5.84%、6～8d为82.67±8.74%。统计分析显示,在整个释放期间,从Chi/NNPs释放的NELL-1的生物活性高于阴性对照组(Chi/BNPs)(P0.05)。新鲜NELL-1溶液的生物活性高于其他三组释放的NELL-1溶液,但统计学无差异(P0.05)。(2)第二部分实验:SEM镜下可见制备的纤维支架呈现无序的三维交错结构,纤维与纤维之间交错成网状。PCL 组、PCL+10%nHA 组、PCL+20%nHA 组、PCL+30%nHA、PCL+40%nHA组的纤维直径分别为 550.90±37.43nm、572.44±35.27nm、581.38±40.58nm、617.18±30.17nm、630.02±60.53nm。TEM 显示纯 PCL 表面光滑,而富含 nHA 的PCL组表面略显粗糙,且可观察到纤维内部有较多的nHA的排列聚集,尤其以PCL+30%nHA组及PCL+40%nHA组效果显著,且其表面的粗糙程度更明显。ART-FTIR结果显示nHA的代表性官能团主要有OH-1、PO43-,纯PCL的主要官能团有C=O、C-H、C-O等,在不同含量的nHA的PCL中,可以发现含有nHA及PCL的主要官能团,可见在静电纺丝制作过程中PCL可将nHA嵌入其中且PCL和nHA的结构成分未发生明显变化。拉伸强度结果显示PCL组强度最高,达到14.98±1.13MPa。随加入nHA量的增加,富含nHA的PCL拉伸强度逐渐降低。PCL+40%nHA组拉伸强度最低,低至6.02±0.98 MPa。接触角检测可见PCL的接触角较大,随着nHA加入量的增加,复合支架材料接触角明显减小,PCL+30%nHA组、PCL+40%nHA组的亲水性明显提高。进一步的吸水率检测结果表明,随nHA加入量的增加,材料的吸水率明显增加,PCL+30%nHA组、PCL+40%nHA组的吸水率明显高于PCL组且差异有统计学意义。CLSM结果显示随着PCL中加入nHA量的变化,细胞粘附数量明显增加,细胞在PCL+30%nHA组、PCL+40%nHA组的数量最多,即PCL中引入羟基磷灰石能够明显促进细胞的粘附伸展。CCK-8的结果表明nHA加入PCL可明显提高MC3T3-E1细胞在支架表面的生长增殖,即nHA嵌入的复合支架材料是没有毒性的。茜素红染色的实验结果表明随nHA含量的增加,矿化作用愈明显,可见纤维支架上具有更多的钙盐沉积,PCL+30%nHA、PCL+40%nHA纤维支架上的钙结节数量和大小明显高于纯PCL纤维支架。nHA的加入可以促进MC3T3-E1细胞ALP的表达,PCL+30%nHA、PCL+40%nHA组的ALP表达升高更显著,差异有统计学意义。RT-PCR显示14天时RUNX2 mRNA在含nHA的PCL复合纤维支架中表达明显升高且nHA含量越大RUNX2 mRNA高表达越明显。而在21d时,RUNX2 mRNA在含nHA的PCL复合纤维支架中表达明显下降,且nHA含量越大RUNX2 mRNA低表达越明显。COL1在含nHA的PCL复合纤维支架中随时间的推移(7d、14d、21d)表达逐渐升高,在nHA高含量组中其表达升高明显。在接种14d时,PCL+30%nHA组及PCL+40%nHA组的OPN mRNA表达升高,在21d,含有nHA的各组(10%nHA组除外)的OPN表达高于纯PCL组且有统计学意义,nHA含量较高的PCL+30%nHA组及PCL+40%nHA组尤其显著。(3)第三部分实验:SEM镜下所示,各组静电纺丝呈现无序结构,纤维与纤维之间交错成网状。纯 PCL 组、PCL/nHA 组、PCL/BNPs 组、PCL/NNPs 组、PCL/nHA/NNPs 组的静电纺丝纤维的直径分别为 550.90±37.43nm、617.18±30.17nm、680.23±29.36nm、689.36±37.04nm、702.72±34.24nm,可见微球的嵌入使PCL纤维直径明显增大且高于纯PCL组(P0.05)。TEM镜下可见纯PCL纤维支架材料粗细较均匀,纤维表面也较光滑;富含nHA的PCL纤维支架有一定的团聚;纳米微球(BNPs或NNPs)嵌入的静电纺丝纤维表面略有突起,直径变粗;微球及nHA被PCL包裹其中。拉伸强度的结果显示nHA、微球的加入可使纤维的拉伸强度降低。接触角及吸水率的结果显示在滴加ddH20 3min后,除PCL组外,其余各组的接触角均有明显降低均小于90°,亲水性明显增加。含有nHA或纳米微球的各组静电纺丝纤维的吸水率明显高于纯PCL组。体外药物释放结果显示PCL/nHA/NNPs组可使药物低浓度持续释放达30天,释放量达到90%以上,PCL/NNPs组与PCL/nHA/NNPs组的释放曲线相似,可明显降低药物的突释。CLSM镜下观察可见细胞在支架材料有明显地粘附生长,含有nHA或微球的各组细胞数量较多,多于纯PCL组。扫描电镜检查结果显示MC3T3-E1细胞在支架材料上有细胞伪足的伸出,形态较好,铺展面积较大。CCK-8结果显示nHA及纳米微球嵌入PCL并未降低支架材料的生物相容性,可明显促进细胞的粘附增殖。ALP检测可见含有nHA或NNPs微球各组有明显促进MC3T3-E1细胞ALP表达。RT-PCR结果显示接种细胞7天时,PCL/nHA组、PCL/NNPs组、PCL/nHA/NNPs组的COL1mRNA表达水平均高于纯PCL组及PCL/BNPs组,差异有统计学意义(P0.05)。接种14、21天天,可见PCL/nHA组、PCL/NNPs组、PCL/nHA/NNPs组的COL1mRNA表达水平均高于纯PCL组及PCL/BNPs组,PCL/nHA/NNPs组的COL1 mRNA表达水平也高于PCL/nHA组,以上差异均有统计学意(P0.05)。接种7天时,各组OPNmRNA低表达,差异无统计学意义。接种 14d 时,PCL/nHA 组、PCL/NNPs 组、PCL/nHA/NNPs 组的 OPN mRNA表达水平均高于纯PCL组及PCL/BNPs组,差异有统计学意义(P0.05),而纯PCL组与PCL/BNP组组间比较无统计学意义(P0.05)。接种21d时,PCL/nHA组、PCL/NNPs组、PCL/nHA/NNPs组的OPN mRNA表达水平均高于纯PCL组及PCL/BNPs组,PCL/nHA/NNPs组的OPN mRNA表达水平亦高于PCL/nHA组,以上差异均有统计学意义。MC3T3-E1细胞接种7d、14d时,RUNX2mRNA在PCL/nHA组与PCL/nHA/NNPs组RUNX2 mRNA的表达水平明显高于其余三组,差异有统计学意义(P0.05),其余各组间比较无统计学意义(P0.05)。接种21d时,RUNX2mRNA的表达明显下降,PCL/nHA组与PCL/nHA/NNPs组RUNX2 mRNA的表达水平明显低于其余三组,差异有统计学意义(P0.05),其余各组间比较无统计学意义(P0.05)。结论:(1)壳聚糖成功包被在BSA凝聚体表面形成纳米微球,其形态稳定,呈球形、光滑、无团聚,粒径适中,具有较高的包封率,可形成生长因子释放的保护屏障进而较好的缓释NELL-1蛋白的释放,且释放的NELL-1具有较高的生物活性。这为生长因子在组织再生的应用提供了新的载药和缓释方式,从而可为骨组织再生提供负载生长因子的生物活性材料,为骨缺损修复的研究奠定基础。(2)nHA嵌入的PCL复合支架材料具有具有三维交联的结构、纤维直径分布较均匀、形态较一致,具有较好的亲水性、较好的拉伸强度(PCL+40nHA组除外)、良好的生物相容性,nHA高含量的复合纤维支架(PCL+30%nHA组及PCL+400%nHA组)更有利于MC3T3-E1细胞的粘附生长增殖,显著促进MC3T3-E1细胞ALP及成骨相关基因(RUNX2、OPN、COL1)mRNA的表达,可明显促进MC3T3-E1细胞的成骨向分化成熟及矿化。综合材料表征及生物活性,PCL+30%nHA组既具有良好的三维结构、较强的亲水性及适宜的机械强度,又具有明显的促进促进MC3T3-E1细胞粘附生长、增殖及成骨向分化,是较理想的富含纳米级生物陶瓷的聚合物复合材料,这可为骨缺损的修复提供新的支架材料。(3)nHA及NELL-1微球嵌入的PCL纤维支架三维交错成网状、nHA及微球成功包裹于PCL纤维中,具有良好的润湿性、拉伸强度及生物相容性,可明显促进MC3T3-E1细胞在支架的粘附生长增殖。壳聚糖微球和PCL纤维支架为NELL-1的释放形成双层保护屏障,可有效的延长生长因子的释放时间,释放的NELL-1蛋白可提高ALP的表达说明释放的生长因子保持有良好的生物活性。nHA及NELL-1微球嵌入的PCL纤维支架促进MC3T3-E1细胞成骨相关基因(RUNX2、OPN、COL1)的表达,促进MC3T3-E1细胞成骨向分化成熟,构建的复合纤维具有良好的成骨活性,这可为骨缺损的修复提供较理想的支架材料。
【图文】：

与其他制备纤维支架的技术如相分离、自组装等技术相比，静电纺丝技术制逡逑备的纤维支架材料具有较一致的纤维直径、形态及孔隙率结构［ｍ１。静电纺丝技术逡逑的基本原理（如图１所示）是在高压电场作用下，针头处的液滴会由球形变为圆逡逑锥形（Ｔａｙｌｏｒ锥），圆锥状的带电液体通过电场并拉伸形成一个向收集器喷射逡逑的稀薄液体喷射流，该液体多为聚合物溶液，其中溶剂在喷射过程中蒸发，聚合逡逑物溶液连续喷射，形成连续的交联的纤维支架结构，形成的纤维支架直径一般在逡逑１０邋ｎｍ邋到邋１０邋ｙ邋ｍ邋之间ｎｎ。逡逑１６逡逑

图１．１壳聚糖包被的ＢＳＡ微球的制备示意图逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08

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