组织工程皮肤支架制备及其全层皮肤构建研究
发布时间：2020-04-21 20:50
【摘要】：组织工程皮肤在临床皮肤再生修复、化学品安全毒理与功效测试以及皮肤疾病研究等领域均有重要的应用。特别是欧美动物替代测试的推广,已造成贸易壁垒,严重影响我国经济发展,迫切需要有效且简便的方法构建组织结构与功能与人体皮肤更加相近的组织工程皮肤。支架材料选择、支架制备、种子细胞与构建方法是组织工程皮肤构建的技术要点。成纤维细胞在支架中均匀分布、增殖生长、活性保持情况,角质细胞在支架上增殖与分化情况以及构建得到的组织结构完整性与功能等,都是全层皮肤构建成败的关键评价标准。基于天然原料生物相容性好,细胞毒性小等优点,我们在组织工程皮肤的构建中选用了海藻酸钠、壳聚糖、胶原、明胶和纤维蛋白作为支架材料。首先利用冷冻干燥法得到了海藻酸钠体积占比100%、60%与20%的海藻酸钠-壳聚糖多孔支架A1、A2和A3,用0.25%戊二醛、0.02M EDC/NHS交联和二次冻干法制得的胶原-壳聚糖支架B1、B2和B3及冷冻干燥后热交联得到明胶支架C1。通过吸水率与孔隙率测试、支架形貌结构观察及对接种成纤维细胞的支架的三维空间细胞分布与增殖情况进行对比,分析不同多孔支架的性能。最终选用吸水率和孔隙率分别大于80%和90%,表面孔径在70-150μm之间且成纤维细胞可在支架中均匀分布并增殖即性能最佳的明胶支架C1进行全层皮肤构建,获得了具有完整真表皮结构,全皮与表皮厚度分别在1000-1100μm之间与50-250μm之间且可正常表达表皮层标记蛋白角蛋白10的全层皮肤。由于冷冻干燥法获得的多孔支架在构建全层皮肤过程中,常需成纤维细胞分泌细胞外基质填充多孔结构后再接种角质细胞,构建周期较长且厚度大的真皮结构,成纤维细胞接种后较难分布均匀。进而我们基于成纤维细胞在不同浓度的纤维蛋白水凝胶的增殖和活性测试结果以及机械性能,最终选用浓度为5 mg/m L的纤维蛋白水凝胶进行全层皮肤构建,获得了具有完整真表皮结构且角蛋白10从第7天到第14天表达量不断上升的全层皮肤。最后我们利用纤维蛋白凝胶以及静电纺丝制得的可使角质细胞有效粘附、增殖与分化的明胶纤维支架,在PEGDA组织培养小室中进行全层皮肤构建。并对通过微流控芯片与自动培养系统构建流体环境,模拟体内养分供给与代谢产物去除的动态过程构建得到的全层皮肤与采用传统静态培养方式构建得到的全层皮肤进行组织结构与活性以及屏障功能形成情况的对比研究。实验结果表明培养八天后,两种构建方式均能获得具有完整真表皮结构的全层皮肤.第六天全层皮肤均保持组织活性,活细胞较多。动态构建相比静态构建方式获得的全层皮肤,死细胞少,但厚度相对较薄。从皮肤屏障测试可知,两种构建方式得到的全层皮肤第六天与第一天相比,阻值明显上升,均能得到具有一定皮肤屏障功能的全层皮肤。本研究通过不同支架构建得到的具有完整真表皮结构的全层皮肤,有很强的应用潜力,可进一步在皮肤再生修复、皮肤疾病的研究、药物筛选与化妆品安全毒理与功效评价等应用方向上开展研究。其中采用纤维蛋白凝胶作为支架对全层皮肤组织结构与功能的完善提供了有利的条件。动态环境构建全层皮肤的方法为进一步提升组织工程皮肤培养环境,开展皮肤相关的多器官共培养研究提供了有效的技术支撑。
【图文】：
皮肤是人体与外界环境的一个重要屏障，也是人体最大的器官，可避免体内水分过量流失，还具有温度调节、感觉、隔热等功能[2]。皮肤由表皮、真皮与皮下组织构成。表皮主要由上皮细胞和树状细胞组成，上皮细胞来源于外胚层，其发生和分化最终阶段是形成含有角蛋白的角质细胞，故又称角质细胞，而树状细胞主要包括朗格罕斯细胞和黑色素细胞。角质细胞由于不同分化阶段以及特点，又可以分为五层，从表面到底部为角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层。真皮是表皮和皮下组织的连接层，是皮肤重要的组成部分，主要由成纤维细胞以及胶原纤维、弹性纤维、透明质酸、纤连蛋白等细胞外基质组成。皮肤中还有毛、指（趾）、皮肤腺和汗腺，是胚胎发生时由表皮衍生的附属结构，称皮肤附属器或表皮附属器，此外皮肤还有丰富的血管、淋巴管和肌肉和神经。表皮厚度在 0.04-1.6 mm 之间，其中眼睑最薄为 0.04 mm，真皮厚度为表皮的 15-40 倍，，0.4-2.4 mm 不等[3]。
图 1-2 2D 与 3D 环境中细胞形态图A） 细胞粘附、形貌、机械性能和可溶性在 2D 和 3D 环境中的示意图[6]；B）成纤维细胞在胶原铺被上与在胶原凝胶中以及被诺考达唑干预后去极化的细胞形貌[7]Fig.1-2 Cell morphology cultured in 2D and 3D situationsA）Adhesive, topographical, mechanical, and soluble cues in 2D and 3D[6]；B) Morphology ofibroblasts cultured on collagen coating dish and collagen gel[7].随着动物实验的替代（Replacement）、减少（Reduction）、优化（Refinement原则即 3R 原则的提出与发展，以及组织工程皮肤领域研究的深入、相关技术的成熟与法规的推进，与皮肤相关的动物实验逐渐被组织工程皮肤所替代。同时由于组织工程皮肤为细胞间通讯提供三维环境而基质环境对细胞增殖、分化、色素沉积有直接影响。此外，表皮与真皮的遗传特征可以在体外实现改变，有利于机制与信号通路方面的研究，也成为研究光老化、皮肤癌、皮肤浮肿等皮肤疾病与药物开发的有效工具。欧盟、美国、日本、韩国等国家都建立了体外研究中心如ECVAM、JCVAM 与 ICCVAM，许多国外的化妆品公司也加大在该领域的投入
【学位授予单位】：广东工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08
本文编号：2635721
【图文】：
皮肤是人体与外界环境的一个重要屏障，也是人体最大的器官，可避免体内水分过量流失，还具有温度调节、感觉、隔热等功能[2]。皮肤由表皮、真皮与皮下组织构成。表皮主要由上皮细胞和树状细胞组成，上皮细胞来源于外胚层，其发生和分化最终阶段是形成含有角蛋白的角质细胞，故又称角质细胞，而树状细胞主要包括朗格罕斯细胞和黑色素细胞。角质细胞由于不同分化阶段以及特点，又可以分为五层，从表面到底部为角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层。真皮是表皮和皮下组织的连接层，是皮肤重要的组成部分，主要由成纤维细胞以及胶原纤维、弹性纤维、透明质酸、纤连蛋白等细胞外基质组成。皮肤中还有毛、指（趾）、皮肤腺和汗腺，是胚胎发生时由表皮衍生的附属结构，称皮肤附属器或表皮附属器，此外皮肤还有丰富的血管、淋巴管和肌肉和神经。表皮厚度在 0.04-1.6 mm 之间，其中眼睑最薄为 0.04 mm，真皮厚度为表皮的 15-40 倍，，0.4-2.4 mm 不等[3]。
图 1-2 2D 与 3D 环境中细胞形态图A） 细胞粘附、形貌、机械性能和可溶性在 2D 和 3D 环境中的示意图[6]；B）成纤维细胞在胶原铺被上与在胶原凝胶中以及被诺考达唑干预后去极化的细胞形貌[7]Fig.1-2 Cell morphology cultured in 2D and 3D situationsA）Adhesive, topographical, mechanical, and soluble cues in 2D and 3D[6]；B) Morphology ofibroblasts cultured on collagen coating dish and collagen gel[7].随着动物实验的替代（Replacement）、减少（Reduction）、优化（Refinement原则即 3R 原则的提出与发展，以及组织工程皮肤领域研究的深入、相关技术的成熟与法规的推进，与皮肤相关的动物实验逐渐被组织工程皮肤所替代。同时由于组织工程皮肤为细胞间通讯提供三维环境而基质环境对细胞增殖、分化、色素沉积有直接影响。此外，表皮与真皮的遗传特征可以在体外实现改变，有利于机制与信号通路方面的研究，也成为研究光老化、皮肤癌、皮肤浮肿等皮肤疾病与药物开发的有效工具。欧盟、美国、日本、韩国等国家都建立了体外研究中心如ECVAM、JCVAM 与 ICCVAM，许多国外的化妆品公司也加大在该领域的投入
【学位授予单位】：广东工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 王军,李新松,赵艳秋,浦跃朴;壳聚糖多孔支架的制备与生物学性质[J];东南大学学报(自然科学版);2004年01期
2 吴林波,丁建东;组织工程三维多孔支架的制备方法和技术进展[J];功能高分子学报;2003年01期
本文编号：2635721
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