微孔化骨软骨脱细胞基质复合ASCs片层促进软骨缺损修复及界面整合

发布时间：2020-05-10 17:35

【摘要】：背景由于固有的结构特征及生物特性使其难以自我修复,软骨再生和修复的困难受到了很多关注。组织或器官的缺损是某些难治性疾病的最终临床表现,如外伤或骨关节炎(osteoarthritis,OA)导致的软骨缺损,骨坏死骨不连导致的骨缺损。随着干细胞技术的运用,细胞治疗已被用来修复缺损,多项研究显示脂肪来源的干细胞具有最好的软骨分化潜能。细胞片层是含有细胞外基质(ECM)的一层完整的片状结构,含有离子通道、生长因子受体和连接蛋白等重要的细胞表面蛋白,具有传统组织工程技术不可比拟的优点。通过特定的培养技术可在一定程度上完整获取该片层而不明显破坏上述结构和成分。理想的关节软骨再生不仅仅指外观的一致性和完整性,还包括修复区域的结构尽可能与原位结构相似,并且新生软骨随着时间的推移进行代谢。缺损边缘组织产生的局部新生软骨形态表明细胞从自体软骨边缘良好地迁移是非常重要的。因此,可以促进细胞迁移,维持结构并提供良好微环境的支架在修复过程中尤为重要。适当的脱细胞步骤可以有效去除软骨组织中的细胞成分,避免移植物-宿主免疫反应造成的结构破坏和ECM丢失,从而保持与天然结构相近的机械和生物性能。微孔化的软骨有助于脱细胞过程中软骨深层细胞的去除,而脱细胞ECM有助于细胞迁移及ECM沉积。本研究探索了微孔化骨软骨脱细胞基质的制备及脂肪源性间充质干细胞(ASCs)片层的获取,并以此为基础,将微孔化骨软骨脱细胞基质复合ASCs片层作为一种生物材料用于兔骨软骨缺损模型并进一步评估这种材料用于骨软骨缺损的软骨修复及整合效果。目的本课题旨在探索兔脂肪来源的ASC细胞片的构建方法,解析不同时间点ASC细胞片的形态特点、组织学特征、潜在软骨分化能力,微孔化骨软骨脱细胞基质的制备及其特性研究,微孔化骨软骨脱细胞基质复合ASCs片层促进兔软骨缺损修复及界面整合的作用。方法在新西兰白兔的髌骨沟中建立全层圆柱形缺损模型,设置骨软骨脱细胞基质组、微孔化骨软骨脱细胞基质组,微孔化骨软骨脱细胞基质复合ASCs细胞片层组,分别将相应的移植物移植于缺损区域。术后6周和12周,经形态学、组织学及分子生物学评估整合和修复效果。结果体外实验中,微孔化骨软骨脱细胞基质复合细胞片层移植培养4周后与周围组织结合紧密,移植物边缘未见明显的孔隙。组织学镜下观察细胞片层填充于缝隙之中并维持着结构连续性。微孔化骨软骨脱细胞基质复合细胞片层组Collagen Ⅱ,Agg和Sox9表达高于对照组,Collagen X低于对照组,且有显著性差异。体内实验中,微孔化脱细胞骨软骨基质复合细胞片层组6周时缺损边界已不明显,修复表面光整,12周时较难辨认出边界及修复区域,表面光整连续。组织学镜下观察到,6周时在微孔化骨软骨脱细胞基质复合细胞片层组中,生成了更多的软骨样组织,软骨下骨可见重塑。12周时在微孔化骨软骨脱细胞基质复合细胞片层中,缺损的上层充满软骨样组织,表面平滑,新生软骨与其宿主软骨及其软骨下骨整合良好。软骨下骨修复重建良好。6周和12周微孔化骨软骨脱细胞基质复合细胞片层组CollagenⅡ,Agg和Sox9表达高于另外两组,CollagenX低于另外两组,且有显著性差异。偏正光显微镜观察显示在微孔化骨软骨脱细胞基质复合细胞片层组中,修复组织内的胶原纤维类似于正常关节软骨组织中的胶原纤维。修复组织内的双折射(胶原含量的指标)略弱于周围软骨。结论将微孔化骨软骨脱细胞基质支架复合ASCs片层的新方法可以增强软骨再生和修复并促进新生软骨与周围软骨整合。
【图文】：

江大学硕士学位论文逦正文．结果逡逑．１邋ＡＳＣｓ形态及三系分化逡逑第三代的ＡＳＣｓ在分离、传代和增殖后呈现梭形形态和均匀分布。成脂诱导见大而圆的脂滴，油红染色成橘红色；成骨诱导分化可见分布的钙结节，染色呈红色；成软骨诱导分化可见软骨微球切面甲苯胺蓝染色呈蓝色的多。三系分化实验表明ＡＳＣｓ具有分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的潜

浙江大学硕士学位论文逦正文结果逡逑表明，短时间内较高浓度的抗坏血酸具有更好的促增殖作用，但是随着时间的增逡逑长，２０ｐｇ／ｍｌ和４０ｐｇ／ｍｌ的抗坏血酸浓度具有更好的促增殖作用，与其他组之间的差逡逑异具有统计学意义，但２0ｎｇ／ｍｌ与４0ｉａｇ／ｍｌ的抗坏血酸浓度对ＡＳＣｓ增殖无显著性差逡逑异，故选择２0ｎｇ／ｍｌ抗坏血酸浓度。逡逑１ｄ逦３ｄ逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08

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