基于仿生策略的新型生物材料制备及其用于毛乳头细胞培养和毛囊重建的研究

发布时间：2020-05-26 22:44

【摘要】：背景和目的组织工程与再生医学的发展让人们看到了秃发治疗的希望。现如今该领域面临两大挑战:(1)毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)是毛囊重建重要的种子细胞,但目前缺乏能兼顾细胞数量扩增与诱导能力维持的培养方法;(2)毛囊重建缺乏能精细化处理细胞与微环境关系的研究模型。要解决这些问题,都离不开新型生物材料所起的关键作用。近年来,仿生学在生物材料领域的运用极大的丰富了材料的实用性和功能性。仿生生物材料有多种实现形式,如直接选用模仿对象的功能性成分参与材料制备,或使用材料模拟出目标组织特定的结构或理化性能。综上所述,本实验将从两个方面进行研究(1)用仿生细胞膜包裹技术修饰具有类细胞外机制微结构的静电纺纳米纤维,探究其作为新型毛乳头细胞培养支架的可行性;(2)使用水凝胶微球和细胞成分作为功能构件,模块化构建具有仿生结构的大体积毛囊重建研究模型。上述研究以期为组织工程方向的秃发治疗研究提出一个新的综合性解决方案。方法1.细胞膜包裹纳米纤维支架材料的构建及生物功能性评价鼠DPCs作为细胞膜来源。使用静电纺丝和细胞膜包裹技术制备仿生DPCs培养支架材料。通过接触角测量、免疫印迹法、荧光表达等方法鉴定细胞膜包裹结果。使用细胞活死染色和CCK-8等方法对材料的生物相容性及DPCs的增殖表现做出评价。2.支架材料特性对DPCs生物学特性影响的研究我们使用SEM和共聚焦三维重建等检测方法对DPCs进行形态学观察,通过对DPCs毛发诱导标记物进行基因表达分析、蛋白定性和定量表达和体内毛囊重建实验来探讨培养模型提供的细胞间交互模拟对DPCs生物学特性的影响,并根据结果进行相关机制的初步讨论。3.基于水凝胶微球模块化构建毛囊重建模型的研究使用生物相容性极好的明胶甲基丙烯酸酰氯(GelMA)作为制备水凝胶微球的原料。首先优化微球直径,微球细胞比例等参数。随后,通过悬滴法制备毛乳头细胞球,在transwell小室中依据毛囊及其微环境的结构特征,有序安排载细胞微球、毛乳头细胞球、新生鼠表皮细胞在空间上的分布,构建仿生化毛囊重建模型并进行体内验证。结果1.通过静电纺丝和细胞膜包裹技术,成功构建了仿生纳米纤维支架细胞培养模型,证实该模型有良好的生物相容性并支持DPCs增殖生长。2.仿生支架材料培养的DPCs表达与毛囊诱导能力相关特异性标记物ALP、β-catenin和Versican,且介导细胞间交互的N钙黏蛋白表达增强。经支架材料培养后的DPCs能在体内诱导毛囊再生。3.使用载细胞水凝胶微球、毛乳头细胞球和毛囊细胞作为功能构件,成功在体外构建出大体积含仿生真皮微环境的毛囊重建模型,并在移植裸鼠后实现毛囊再生。结论1.细胞膜包裹的纳米纤维支架材料是一种新型的DPCs培养模型。2.支架材料中仿生结构与细胞表面交互活性的协同作用可有效增强以非聚集性方式生长的DPCs的细胞间交互作用,使其恢复特异性标记物的表达以及诱导毛囊再生的能力,为组织工程毛囊提供了新的种子细胞培养工具。3.基于模块化的组织构建模式能有效恢复毛囊细胞与真皮微环境的位置关系,有助于构建细胞节省型的毛囊重建模型。
【图文】：

逑＿＿＿逡逑图１－ｈ小鼠触须毛乳头细胞的体外原代培养及观察。Ａ．显微解剖法结合酶消化法分离获逡逑得的ＤＰ；邋Ｂ．ＤＰ接种３天后；Ｃ．接种７天后。比例尺＝１００卜ｍｉ。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｔｈｅ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ邋ｍｉｃｅ邋ｖｉｂｒｉｓｓａｅ邋ｄｅｒｍａｌ邋ｐａｐｉｌｌａ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ．逡逑Ａ．邋Ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｄｅｒｍａｌ邋ｐａｐｉｌｌａ邋ａｆｔｅｒ邋ｍｉｃｒｏ－ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ邋ｃｏｍｂｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；邋Ｂ．邋３ｒｄ邋ｄａｙｓ邋ｏｆ逡逑ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ；邋Ｃ．邋７ｔｈ邋ｄａｙｓ邋ｏｆ邋ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒｓ＝邋１００ｊ．ｉｍ．逡逑２．纳米支架材料的形态观察逡逑我们使用扫描电镜来观察不同接收装置对纳米纤维结构的影响，分别为喷逡逑纺在玻片（图１－２Ａ）和铝箔上（图１－２Ｂ）。两图中均可见方向随机的纳米纤逡逑维丝较为均匀的分布在视野中，但在直径上存在着明显的差异（图１－２Ｃ）。根逡逑据电镜照片，我们在每组中随机挑选了邋２０条纤维进行直径测量，玻片组中纤维逡逑的平均直径为１７３±１０．２ｎｍ，而铝箔组中纤维的平均直径为９４７±７６．１ｎｍ。上述逡逑结果符合我们的设计预期，，同时说明我们成功制备了纳米级的原始细胞培养支逡逑架。逡逑Ｇｌａｓｓ逦Ａｌｕｍｉｎｕｍ逡逑■歐■逡逑Ｃｏ？ｅｃｉ0ｆ逡逑图１－２：静电纺纳米纤维电镜观察。Ａ．玻璃接收器；Ｂ．铝箔接收器；Ｃ．平均纤维直径＊ｐ＜逡逑０．０５，（ｘ土ｓ邋，邋ｎ＝３邋）。比例尺＝５ｐｍ逡逑１１逡逑

２．纳米支架材料的形态观察逡逑我们使用扫描电镜来观察不同接收装置对纳米纤维结构的影响，分别为喷逡逑纺在玻片（图１－２Ａ）和铝箔上（图１－２Ｂ）。两图中均可见方向随机的纳米纤逡逑维丝较为均匀的分布在视野中，但在直径上存在着明显的差异（图１－２Ｃ）。根逡逑据电镜照片，我们在每组中随机挑选了邋２０条纤维进行直径测量，玻片组中纤维逡逑的平均直径为１７３±１０．２ｎｍ，而铝箔组中纤维的平均直径为９４７±７６．１ｎｍ。上述逡逑结果符合我们的设计预期，同时说明我们成功制备了纳米级的原始细胞培养支逡逑架。逡逑Ｇｌａｓｓ逦Ａｌｕｍｉｎｕｍ逡逑■歐■逡逑Ｃｏ？ｅｃｉ0ｆ逡逑图１－２：静电纺纳米纤维电镜观察。Ａ．玻璃接收器；Ｂ．铝箔接收器；Ｃ．平均纤维直径＊ｐ＜逡逑０．０５，（ｘ土ｓ邋，邋ｎ＝３邋）。比例尺＝５ｐｍ逡逑１１逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R622;R318.08

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本文编号：2682512