Ad-TGFβ1感染BMSCs黏附3D打印PLA支架软骨细胞分化的实验研究

发布时间：2020-05-30 13:49

【摘要】：目的:研究Ad-TGFβ1感染BMSCs黏附3D打印PLA支架的软骨细胞分化性能,为BMSCs-PLA复合支架进行体内修复兔关节软骨缺损提供实验依据。方法:1、2月龄新西兰大白兔缺氧处死,从双后肢股骨、胫骨中分离出BMSCs培养,每2-3天观察其生长情况,直至培养至第三代细胞(P3)备用;2、Ad-TGFβ1扩增,检测扩增后Ad-TGFβ1滴度;取扩增后的Ad-TGFβ1感染BMSCs细胞,TGFβ1基因成功导入BMSCs细胞,同法用Ad-TGFβ1空载体导入BMSCs后备用。第7天时用荧光显微镜在观察绿色荧光细胞数量,计算空载组和感染组的感染效率。3、制作兔膝关节软骨缺损模型,进行膝关节CT扫描,收集软骨缺损原始数据,以PLA为打印材料设计支架孔径100μm,运用3D技术制作软骨缺损支架,用2mol/L Na OH溶液对PLA支架进行表面改性后。消毒备用。4、取18个PLA支架,随机将其中6个PLA支架和Ad-TGFβ1感染组BMSCs共培养,另随机6个PLA支架和空载组细胞共培养,剩余6个PLA支架和空白对照组BMSCs细胞共培养。每2-3天换液,细胞计数法测定各组细胞在PLA支架上的黏附率。5天后扫描电镜观察细胞黏附情况。CCK8检测各组细胞在PLA支架上的细胞活力。取各组支架细胞复合物进行成软骨诱导,7天后进行甲苯胺蓝染色检测软骨细胞分化效果,q PCR检测TGFβ1 m RNA的相对表达量,Western blot检测COL-Ⅱ表达量;用SPSS22.0软件进行数据统计分析,计量资料服从正态分布用均数±标准差(±s)表示,三组及三组以上使用方差分析,两两对比使用LSD检验,以P0.05为差异有统计学意义。结果:1、从兔骨髓组织中成功分离出BMSCs;2、构建的Ad-TGFβ1感染HEK293细胞后出现明显CEP现象,Ad-TGFβ1病毒滴度检测为5xl08PFU/m L。成功将扩增后的Ad-TGFβ1感染BMSCs,感染效率高达80%。3、采用3D打印技术制备出孔径大小100μm PLA软骨缺损支架。4、电镜扫描示各组PLA支架表面均有细胞黏附,见有线状突起伸展贴附于支架上,但BMSCs与PLA支架共培养各组细胞黏附率差异明显,转染组细胞黏附率最高组间比较有统计学意义(P0.05)。各组支架细胞复合物成软骨诱导第7天进行TGFβ1m RNA的相对表达量检测,转染组TGFβ1m RNA的相对表达量为2.28±0.13,显著高于空白组和空载组,差异有统计学意义(P0.05)。甲苯胺蓝染色感染组细胞核呈蓝紫色,空载组及空白组甲苯胺蓝染色阴性。电泳结果显示感染组条带染色深,COL-Ⅱ相对表达量为1.40±0.06,较空白组及空载组高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1、3D打印PLA支架表面改性处理后能够增强Ad-TGF?1感染BMSCs PLA支架黏附性能。2、Ad-TGF?1感染BMSCs黏附3D打印PLA支架能够诱导分化为软骨细胞。
【图文】：

关节软骨缺损模型制作并进行 CT 扫描 A：软骨缺损造模前兔膝关节股骨远端图片；B：节股骨远端图片（直径 3.5mm 深 2mm ）；C：实验兔麻醉状态下进行 CT 扫描；D：兔右软骨缺损图像。D 图中“↑”提示兔膝关节软骨缺损。 打印 PLA 支架实验所用 PLA 长丝（直径 1.75 mm）及台式 3D 打印机（图 2）由天公司提供。打印单位为珠海市香洲区第二人民医院，3D 打印基地。文件格式由.stl 文件修改为.gcode 文件。并运用 Simple3D 软件进 3）：编辑兔软骨缺损区域 CT 三维重建图像（图 3A），创建硬组像素，切除剩余的健康骨组织，仅保留软骨缺损区域图像(图 3B、像内进行网格填充，填充约 70%，去除顶盖，打印尺寸为直径 3.5 m计出 3D 打印前预模型(图 3D）；连接天威 3D 台式打印机进行 PLAD 打印喷头在 210 ℃的固定温度下挤出 PLA。打印速度控制为精确10 ℃，最终打印出的 PLA 支架大小为直径 3.5 mm，深 2 mm(图 3E

学硕士学位论文 二0一九年五月 支架表面改性处理：取 PLA 支架置于 2 mol/L NaOH 溶液中，并在恒反应 30 min。用蒸馏水清洗 3 次，真空干燥，紫外线消毒灭菌 3
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08

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本文编号：2688221