基于链置换驱动DNA自组装与催化核酸的microRNA-122-5p生物传感体系的建立与评价

发布时间：2020-06-10 11:33

【摘要】：目的:基于链置换驱动DNA自组装与催化核酸(G-四链体辣根过氧化物模拟酶)建立一种简单、快速、灵敏且特异的microRNA-122-5p(miR-122-5p)生物传感新体系,并对该检测体系进行评价,为miR-122-5p的检测提供一个全新的策略。方法:1、检测体系的建立:(1)根据miR-122-5p序列设计三个发卡探针Hairpin1(HP1)、Hairpin2(HP2)和Hairpin3(HP3)。利用miR-122-5p引发链置换反应,驱动三个探针自组装形成兼容富G序列的DNA三叉结构。琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜分别从分子量及形态结构上验证DNA三叉结构是否构建成功。(2)富G序列在螯合了氯化血红素(Hemin)之后形成G-四链体。利用G-四链体具有辣根过氧化物模拟酶活性和可作为淬灭基团的特性分别构建化学发光传感平台和荧光传感平台。通过对比实验组(有miR-122-5p)与对照组(无miR-122-5p)时化学发光信号强度和荧光信号强度,初步验证这两个平台的可行性。采用正交实验法,对化学发光和荧光传感平台的关键实验条件进行优化(反应时间、反应温度、氯化血红素(Hemin)浓度、HP1/HC1(-CY3)、HP2/HC2(-CY3)和HP3/HC3(-CY3)的浓度等)。2、检测体系的评价:对比化学发光传感平台和荧光传感平台的灵敏度,选择灵敏度较高的传感平台,并继续对其重复性、特异度、基质效应和稳定性等方面进行评价。结果:1、检测体系建立:(1)琼脂糖凝胶电泳结果显示:miR-122-5p+HP1+HP2+HP3的泳道有150bp大小的电泳条带出现,而HP1+HP2+HP3的泳道只有50bp大小的电泳条带出现。原子力显微镜可以直观的看到约20 nm大小的DNA三叉结构形成。(2)化学发光传感平台可行性分析显示,实验组的发光强度为12369.17±1120.37 a.μ.,对照组的发光强度为3098.01±121.35 a.μ.,差异有统计学意义(P0.01)。正交实验结果显示,最佳反应时间、反应温度、Hemin、HP1、HP2和HP3的浓度分别为90min、42℃、100nM、150nM、200nM和100nM。荧光传感平台可行性分析显示,实验组的荧光强度为85.19±5.36 a.μ.,对照组的荧光强度为213.7±14.99 a.μ.,差异有统计学意义(P0.01)。正交实验结果显示,最佳反应时间、反应温度、Hemin、HC1(-CY3)、HC2(-CY3)和HC3(-CY3)的浓度分别为60min、42℃、100nM、150nM、200nM和100nM。2、检测体系评价:灵敏度分析显示,化学发光传感平台的最低检测限为1.02 pM,荧光传感平台的最低检测限为5.70 fM。重复性实验显示:不同浓度miR-122-5p的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均为低于7%。特异性分析显示:单碱基错配序列(single-base mismatched sequence,SM)、双碱基错配序列(double-base mismatched sequence,DM)、四碱基错配序列(four-base mismatched sequence,FM)和miR-21引发的荧光强度都高于miR-122-5p引发的荧光强度,差异有统计学意义(P0.01)。基质效应分析显示:不同浓度miR-122-5p的RSD均低于6.5%。稳定性分析显示:1天、2天、3天、4天、5天分别测得的荧光强度值之间差异无统计学意义(P0.05)。结论:基于DNA链置换反应成功构建了DNA三叉结构,并结合催化核酸G-四链体的信号放大功能实现了miR-122-5p的灵敏检测。荧光传感平台的灵敏度要高于化学发光传感平台,最低检测限可达5.70fM,且重复性好,可以识别单碱基错配,稳定性好,这为miR-122-5p的检测提供了一个全新的传感检测策略。
【图文】：

基 于miR-122-5p 的序列采用 Nupack 软件设计三个发卡探针 HP1、HP2 和 HP3。如图1-1 所示，HP1 的（a）区为富含鸟嘌呤（G）序列，（b）区是 miR-122-5p 的特异性识别区域。HP2 的（c）区为富含鸟嘌呤（G）序列，，（d）区可以与 HP1 的3’端颈部序列结合。HP3 的 e 区可以与 HP2 的 3’端颈部序列结合。粉红色点表示在在荧光传感体系中，我们在探针的 5’端标记了 CY3 荧光分子。图 1-1 发卡探针 HP1、HP2 和 HP3Fig. 1-1 Hairpin probe HP1、HP2 and HP3

图 1-2 基于链置换的 miR-122-5p 化学发光传感检测原理图Fig. 1-2 Schematic diagram of miR-122-5p chemiluminescence sensing detection based onstrand displacement
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TP212.3;R318

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本文编号：2706235