【摘要】：研究目的钛(Ti)及其合金(主要是Ti-6al-4v)因其良好的机械性、生物相容性和稳定性,被广泛应用于医学领域中。Ti02具有耐腐蚀性并有利于细胞附着和随后的细胞外基质沉积,但由于其表面光滑,无法有效募集宿主细胞进行组织整合,近年来,人们研究了多种钛种植体表面修饰方法以加快植入体的骨结合速度,有研究发现,通过不同的方法对TiO2纳米管的表面结构进行修饰,可改变Ti02材料的表面粗糙度,并且表面蛋白质或多肽涂层后可以促进细胞的粘附和生长。其中,骨涎蛋白的肽片段苯丙氨酸-组氨酸-精氨酸-精氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-丙氨酸Phe-His-Arg-Arg-Ile-Lys-Ala(FHRRIKA)可促进人类胚胎干细胞粘附和自我更新,在Ti02表面涂覆FHRRIKA可诱导间充质干细胞的粘附和成骨分化。为了探究FHRRIKA修饰的Ti02纳米管膜对人成骨细胞和牙龈成纤维细胞的生物活性的影响,分析表面修饰技术对设计和开发新的牙种植体的临床意义,我们首次对FHRRIKA修饰的Ti02纳米管进行了表征,并检测修饰表面上人成骨细胞牙龈成纤维细胞的生物学行为,以提高种植体周围骨结合的速度。研究方法1.首先分离来自同一供体牙槽骨成骨细胞和牙龈成纤维细胞,用胶原酶I消化,制备单细胞悬浮液,在DMEM/F12培养基中分别进行体外培养2周(约3-5代)后,用胰蛋白酶消化细胞,并将两种细胞接种到6孔板培养至融合状态,然后对两种细胞分别加入成骨分化培养基诱导分化3周,根据试剂盒操作说明,使用TRIzol提取两种细胞的总RNA,并采用RT-PCR方法检测两种细胞的成骨标志物基因的表达水平,基因分别为Runt相关转录因子(RunX2)、骨钙蛋白(osteocalcin,OC)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨涎蛋白(bone sialoprote-in,BSP)等。2.通过阳极氧化法在20V条件下处理薄的钛箔3小时,制备直径均匀(100nm)的TiO2纳米管层薄膜。将TiO2纳米管层浸入1x10-2mol/L3-氨基丙基-三乙氧基硅烷的无水己烷溶液中2小时进行硅烷化处理,随后将TiO2纳米管层与FHRRIKA肽片段(2mg/cm2)在无水二甲基甲酰胺(DMF)(1mm)中固定2小时。然后将荧光素异硫氰酸酯缀合的FHRRIKA肽采用同样的条件与TiO2纳米管层固定,通过荧光显微镜检测钛纳米管是否成功包被。随后采用溅射涂布机涂布和扫描电子显微镜观察阳极氧化纳米管层和肽固定化后的微观结构(100,000倍放大成像),并采用倒置光学原子力显微镜系统观察肽涂覆TiO2纳米管层表面的粗糙度,扫描参数:扫描速率为0.5Hz,扫描面积约为1x1μm2,最后使用NanoNavi软件对纳米管层表面的粗糙度进行量化。3.将牙槽骨成骨细胞和牙龈成纤维细胞分别装载到FHRRIKA修饰的阳极氧化TiO2纳米管表面,作为实验组。同时以未用FHRRIKA肽修饰的纳米管作为对照组。接种培养4小时后,分别进行以下实验:1)样品用磷酸盐缓冲液冲洗及戊二醛固定后,采用金溅射镀膜,并用FEI SIRION 200系统成像对细胞形态进行观察;2)同样对细胞进行冲洗固定后,先用1%牛血清白蛋白进行封闭,然后使用单克隆抗肌动蛋白抗体作为一抗(1:2000),兔抗小鼠异硫氰酸荧光素偶联的抗体作为二抗(1:500)温育处理后,细胞核使用DAPI染色,最后将样品固定在载玻片上并对两组细胞的细胞骨架中肌动蛋白进行共焦激光扫描显微镜观察及免疫荧光检测;3)用磷酸盐缓冲液冲洗细胞后,采用钙黄绿素和乙啶二聚体分别对细胞进行染色,通过在荧光显微镜下观察活细胞的比例对细胞活力进行测定。此外,在细胞接种培养的第7天和第14天,对FHRRIKA肽修饰纳米管表面的细胞进行洗涤并裂解,采用活性检测法检测碱性磷酸酶(ALP)的活性,并通过RT-PCR方法检测Runt相关转录因子(RUNX2)、骨钙蛋白(OC),骨桥蛋白(OPN)和骨涎蛋白(BSP)的相关成骨标志物基因的表达分析细胞分化情况。实验最后对所得结果采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。数据以平均值标准差表示。以P0.05作为阈值,并采用配对样本t检验来比较每个因变量差异。研究结果1.实验成功分离并培养了供体同源的牙槽骨成骨细胞和牙龈成纤维细胞,并进行了成骨细胞和牙龈成纤维细胞的鉴定,细胞在DMEM培养基中培养时均显示为梭形、多边形或多角形,当采用成骨分化培养基诱导分化3周后,von Kossa染色发现,在成骨细胞中发现矿化基质沉积,并检测到矿化结节,在牙龈成纤维细胞中几乎检测不到矿化。成骨标志物RUNX2、骨钙蛋白(OC),骨桥蛋白(OPN)和骨涎蛋白(BSP)在成骨细胞中的表达显著高于牙龈成纤维细胞。2.肽涂层表面包被实验发现,功能化的Ti02表面显示出肽浓度依赖性的荧光强度,并且肽浓度稳定在1.6mg/cm2,因此我们推断FHRRIKA肽可稳定涂覆在Ti02纳米管膜表面。通过扫描电子显微镜检查发现,与阳极氧化Ti02纳米管的表面结构相比,FHRRIKA多肽修饰没有改变Ti02纳米管膜的表面拓扑结构,两组纳米管的直径均约为100nm。通过原子力显微镜研究数据显示,肽功能化修饰没有显著改变阳极氧化纳米管层表面的粗糙度,纳米管层表面较为均一的纳米孔有利于细胞外基质蛋白的结合。3.通过扫描电镜观察发现,成骨细胞和牙龈成纤维细胞均可在FHRRIKA多肽修饰的Ti02阳极氧化纳米管表面成功附着,但其表面粘附的成骨细胞数量约为牙龈成纤维细胞的2倍,即FHRRIKA修饰可选择性地富集成骨 细胞。在FHRRIKA修饰的Ti02纳米管表面上,成骨细胞和牙龈成纤维细胞形成良好的组织细胞骨架结构,而在未修饰的纳米管表面上细胞骨架结构相对混乱。在修饰和未修饰Ti02纳米管表面上的两种细胞之间未观察到形态学差异。FHRRIKA修饰的纳米管表面的附着细胞数量比未修饰的纳米管表面较多,且修饰表面较多附着的为成骨细胞,这可能是因为源自骨涎蛋白的FHRRIKA基序对成骨细胞附着具有选择性。对分化培养7天和14天的细胞碱性磷酸酶活性检测发现,FHRRIKA修饰的纳米管表面上的成骨细胞的碱性磷酸酶活性比未修饰的纳米管表面上的成骨细胞明显增高,而在修饰和未修饰的纳米管表面上几乎检测不到牙龈成纤维细胞的碱性磷酸酶活性。对成骨标志物基因表达分析发现,成骨细胞的成骨标记物表达水平在分化诱导2周内显著增加。结论及意义本研究中我们首次成功地将FHRRIKA肽膜涂覆在TiO2纳米管表面,FHRRIKA肽修饰可选择性地富集成骨细胞并增强其附着能力。FHRRIKA肽修饰涂层促进成骨细胞的成骨活性,促进成骨细胞的成骨和矿化基质的沉积,具有促进Ti02纳米管植入体的骨结合的潜能,并为种植体设计提供新的表面修饰。因此,FHRRIKA涂层可促进Ti02纳米材料植入物与周围骨组织结合,并为临床设计种植体的表面修饰提供新的思路。
【图文】：
Ａ：倒置相差纤维镜下成骨细胞（ｘ邋１00）逡逑Ｔｈｅ邋ｆｉｒｓｔ邋ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ邋ａｆｔｅｒ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｆｏｒ邋３邋ｄａｙｓ邋（ｘ邋１００）逡逑图１为原代培养的成骨细胞在倒置相差显微镜下观察到的生长情况。从图逡逑片中可以看出，原代培养３天后可见，原代培养的成骨细胞多呈梭形、三角形逡逑或星形的不规则形态，细胞形态饱满，边界清晰，表面较光滑。逡逑２９逡逑
图２成骨细胞增殖曲线（酶联免疫检测仪）逡逑Ｆｉｇ．邋２Ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆｐｒｉｍａｒｙ邋ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ逡逑从图２可以看出，本次原代培养的成骨细胞在前１？３天为细胞生长潜伏逡逑期，３？７天为细胞对数增殖期，７天后进入平台期。逡逑１．３．３喊性淲酸酶染色结果逡逑心．愈Ｗ，卜．：撼；逡逑图３成骨细胞碱性磷酸酶染色阳性（ｘ邋１００）逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ａｌｋａｌｉｎｅ邋ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ邋（ｘ邋ｌ00）逡逑由图３中可以观察到：染色后成骨细胞核呈蓝紫色。逡逑３０逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R783.1
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本文编号：2709099
