多巴胺介导钛表面纳米银涂层的构建及其抗菌和成骨活性评价

发布时间：2020-06-18 08:00

【摘要】：研究目的钛及其合金具有优良的机械性能、抗腐蚀性能和生物相容性,是口腔种植体的首选材料。但是钛表面致密的氧化层使得材料呈现一定的生物惰性,导致其植入体内后骨结合较为缓慢;另外该表面不具有抗菌能力、易粘附细菌并形成生物膜,进而引发感染或种植体周围炎,甚至导致治疗失败。故提升材料表面骨结合能力和赋予表面抗菌能力对种植体应用具有重要价值。在众多的钛表面改性方法中,碱热处理可通过调控表面形貌、化学组成、亲疏水性等影响其生物学性能,且具有操作简单且易控制的特点。可以构建出微米级和纳米级孔复合的层级多孔结构,同时表面富含羟基和具有超亲水性能,为随后的生物分子修饰奠定了良好的基础。仿海洋贻贝粘附性的多巴胺分子具有邻苯二酚和氨基,其可以1)自身聚合形成具有更多活性反应基团的聚多巴胺,2)牢固粘附在众多材料表面改善生物相容性,3)实现其他生物分子在材料表面的桥连;4)可以螯合甚至还原金属离子。这些性能使其成为种植体表面改性的重要选择。在广谱抗菌剂中,银具有抗菌能力强、稳定性高、不引发细菌耐药性等优点。与传统银离子相比,纳米尺度的银因尺寸小、比表面积大,具有更强的抗菌能力。本研究通过在纯钛表面进行改性处理,充分利用多孔结构的承载能力和多巴胺的还原能力,期望构建出具有良好的骨结合能力及抗菌性能的多功能涂层,加速种植体植入后的骨结合,同时防止种植体周围炎症的发生,提高种植修复的成功率。另外,本研究对光滑表面和多孔表面上构建的聚多巴胺-纳米银涂层的性能做了详细比较,为种植体设计提供理论和技术支持。研究方法(1)采用碱热处理的方法,在光滑钛表面构建多孔形貌,然后利用水相多巴胺沉积,在多孔钛表面沉积聚多巴胺涂层,最后浸没于不同pH值的硝酸银溶液中,利用多巴胺的还原能力在不同酸碱环境中的多孔钛表面构建聚多巴胺-纳米银涂层。通过场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)、能量色散谱仪(EDS)、X射线光电子能谱(XPS)进行理化性能表征,评估不同酸碱环境对于多巴胺介导纳米银涂层构建的影响。(2)在适宜的酸碱环境中通过相同的方法将银离子在光滑钛表面上也还原为纳米银。通过FE-SEM、XPS、接触角测试仪比较光滑表面和多孔表面构建的各步样品的理化性能及表面润湿性能差别。(3)通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)比较光滑钛表面和多孔钛表面聚多巴胺-纳米银涂层中银离子在矿化液中的释放行为,以及多孔纳米银涂层中银离子在矿化液和在去离子水中的释放行为。(4)通过活死细菌荧光染色、抑菌环试验、浊度法(微生物增殖曲线),考察各制备样品对六种口腔常见微生物的抗菌性能,包括革兰氏阴性菌:大肠杆菌(E.coli和革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌(S.aureus)、变形链球菌(S.mutans)、衣氏放线菌(A.israelii)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和真菌:白色念珠菌(C.albicans)。(5)通过将各制备样品浸泡于仿生矿化液中,模拟样品植入体内后表面性质的变化,并通过FE-SEM和XPS分析各样品表面矿化后的形貌和化学成分组成的变化,分析所得涂层是否具备促进种植体表面非细胞介导的成骨潜能。(6)通过细胞肌动蛋白荧光染色、MTT法及碱性磷酸酶(ALP)活性,分析各制备样品表面及纳米银涂层矿化表面对小鼠胚胎成骨细胞(MC3T3-E1)的影响,评价样品表面对细胞介导的成骨潜力。研究结果(1)FE-SEM、EDS、XPS结果显示硝酸银溶液的pH值影响多巴胺介导的纳米银涂层的构建,相对于酸性及中性环境(pH4、pH7),碱性环境(pHI0)更利于纳米银的沉积,获得的纳米银颗粒数量更多、尺寸更小、分布更均匀。(2)碱热处理后在光滑钛表面形成大量开放型微纳米多孔结构,孔壁为大量支柱样结构,支柱的壁厚约30-50nm。随后在微纳米多孔表面和光滑表面均成功构建聚多巴胺涂层和聚多巴胺-纳米银涂层。与光滑表面聚多巴胺-纳米银涂层相比,多孔表面的涂层获得数目更多、尺寸更小(20-40nm),且形状更均匀的纳米银颗粒。(3)碱热处理后的多孔表面水接触角为25.3±4.1°,较光滑表面(79.0±6.4°)的亲水性得到明显改善;在光滑表面,多巴胺修饰后接触角为66.5±3.4°,亲水性得到改善,但纳米银使表面疏水,接触角略微增加到72.3±3.5°;多孔表面上,聚多巴胺和纳米银则相继影响了表面亲水性,接触角分别增加到50.2±5.4°和76.5±6.7°。(4)ICP-OES结果显示光滑表面聚多巴胺-纳米银涂层在矿化液中呈现了缓慢下降、较高剂量的银释放,而多孔纳米银涂层在矿化液中则呈现为初始阶段高剂量释放、随后低剂量释放。30天后光滑表面涂层中和多孔表面涂层中仍然存在0.11±0.05μg和0.09±0.02μg的银释放,均显示出良好的持续性;多孔纳米银涂层在去离子水中呈现稳定的、高剂量的银释放,累积释放曲线近似于线性,同矿化液中银释放方式明显不同。(5)样品表面活死细菌荧光染色结果显示碱热处理后的多孔表面相对于光滑表面更容易受微生物粘附,在纳米银修饰后,无论是多孔涂层表面还是光滑涂层表面都抑制了六种口腔常见微生物在其上的粘附;抑菌环实验显示纳米银修饰的涂层表面均出现明显、透明的抑菌环,两种涂层均可一定范围内抑制周围环境的微生物增殖;浊度法结果显示两种纳米银修饰的涂层完全抑制了液体环境中的微生物生长,均获得了良好、稳定的抗菌性能。(6)矿化实验后FE-SEM、XPS结果显示碱热处理后的多孔表面相对于光滑表面可以形成更多的矿化产物;聚多巴胺涂层表面的矿化产物最多;多孔表面聚多巴胺-纳米银涂层的矿化产物多于光滑表面聚多巴胺-纳米银涂层,提示多孔纳米银涂层相对于光滑纳米银涂层具有更高的非细胞介导的成骨潜能。不同涂层矿化程度跟表面结构及表面暴露聚多巴胺的量有关。(7)样品表面细胞肌动蛋白荧光染色结果显示纳米银的修饰推迟了成骨细胞的粘附和铺展,但随着培养时间的延长,纳米银涂层表面的成骨细胞MTT、ALP活性均为上升趋势。在对应的时间点,多巴胺介导的矿化涂层表面粘附的成骨细胞数量、形态均优于非矿化的涂层表面,MTT、ALP活性同样高于非矿化纳米银涂层组。此外,相对于光滑结构的纳米银涂层矿化表面,多孔结构的纳米银涂层矿化表面更有利于成骨细胞的粘附、增殖和分化,显示出更理想的细胞介导的成骨潜力。结论与意义本研究通过碱热处理、水相多巴胺沉积、硝酸银溶液浸泡,在微纳米多孔或光滑的钛表面上成功构建聚多巴胺-纳米银涂层。相对于酸性及中性环境,碱性环境的硝酸银溶液更利于多巴胺介导的纳米银沉积;而相对于光滑表面的纳米银涂层,多孔表面上获得了数目更多、尺寸更小的纳米银颗粒,且多孔表面暴露了更多的多巴胺,诱导了更多的矿化,这导致多孔表面纳米银涂层初期银快速释放后,后期纳米银释放快速减少。两种表面构建的纳米银涂层都显著抑制了微生物的粘附与增殖,抗菌性能没有明显差异,证明该修饰涂层解决了多孔表面易发生感染的问题,但纳米银涂层推迟了成骨细胞的粘附与增殖,而多巴胺介导的矿化改善了表面成骨细胞相容性,尤其多孔表面纳米银涂层。因此,本研究推测多孔表面纳米银修饰的涂层材料在植入后初期可以发挥优越的抗菌性能,降低感染风险,植入后随着从体液中逐渐吸附钙磷元素将快速形成矿化层,进一步改善了细胞相容性并促进成骨分化,从而实现骨结合,这符合体内要求,具有临床应用潜力。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R783.1
【图文】：

种植体,微米级,纳米级

促进快速有效的骨结合是目前种植体表面处理发展的趋势ＦＩ。然而，材料表面不逡逑同的微观形貌会产生不同的生物学响应，骨与种植体表面不同尺度上的相互作用逡逑如图１．２所示【１７］。首先，从生物力学角度来看，微米级表面会加强分子的转运和逡逑促进纤维蛋白的吸附及成骨细胞的迁移纳米级结构影响细胞的粘附和排列方逡逑式；第二，从物理角度来看，微米级形貌在增加材料表面的粗糙度的同时也大大逡逑增加了材料的表面积，使得种植体与骨组织之间会形成强烈的生物学固定［｜９］。而逡逑纳米级的表面形貌更加接近于骨组织的形貌，从而具有更好的仿生学效应可逡逑以更好的模拟细胞生长的细胞外基质（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｍａｔｒｉｘ，邋ＥＣＭ）微环境口。第三，逡逑从分子观点来看，微米级结构表面存在很多分子信号假说，而纳米级结构表面可逡逑以粘附纳米尺寸的信号传感器和细胞受体，进而影响细胞的生物学活性逡逑Ｍａｃｒｏｓｃａｌｅ逦Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ逦Ｎａｎｏｓｃａｌｅ逡逑Ｂｏｎｅ邋Ｉｍｐｌａｎｔ逦Ｃｏｌｌａｇｅｎ邋＆逡逑Ｏｔｈｅｒ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑图１．２在宏观上，种植体对骨提供良好的固定。在微观尺度，微米级特征可逡逑以与成骨细胞和间充质干细胞相互作用；而纳米级特征

位置分布,贻贝,多巴,粘附蛋白

植入部位需要尽快恢复正常机能，即实现良好的骨结合，降低外来微生物的影响。逡逑从这个角度而言，种植体良好的骨结合能力和抗菌能力是相辅相成、相互促进的。逡逑１．４聚多巴胺逡逑１．４．１聚多巴胺简介逡逑在自然界中，海洋贻贝可以稳定的粘附在岩石、船体或其他动植物体上，表逡逑现出强大的粘接性能。其原因是贻贝触角的足腺细胞可以分泌出一种粘液，主要逡逑成分是贻贝足丝蛋白（＼＾丨丨１＾＜１１１丨丨５１＇0（＾１＇0１0丨１１５，１＼／＾和），它能够牢固的粘附在各逡逑种物质的表面。在该足丝蛋白中存在５种含有３，４－二羟基苯丙氨酸逡逑（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ邋，邋ＤＯＰＡ，多巴）的粘性蛋白，分别是邋ＭｌｆｐｈＭｅｆｐ〕、逡逑Ｍｅｆｐ３、Ｍｅｆｐ４和Ｍｅｆｐ５，其中足丝粘结界面的位置分布的Ｍｅｆｐ３和Ｍｅｆｐ５中逡逑ＤＯＰＡ含Ｍ较高，且粘结性能与ＤＯＰＡ的含量成正比Ｍ。ＤＯＰＡ中的邻苯二酚基逡逑团是使其具备粘附能力的关键性结构。逡逑ｕ逦１邋ｓｓｅｅｙｋｇｇｙｙｐｇｎａｙｈｙｈｓｇｇｓｙｈｇ逡逑

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