二氧化钛纳米管载银纳米颗粒通过调节巨噬细胞自噬和活性氧清除促进成骨免疫反应的研究

发布时间：2020-06-18 09:42

【摘要】：目前骨科常用的内植入物材料在植入机体后通常都会受宿主反应的影响,特别是与巨噬细胞相关的免疫反应,在后期骨愈合过程中起着重要作用。因此,适当的调控局部免疫反应,通过构建具有骨-免疫调节功能的生物材料以作为骨科内植入物是一种具有良好前景的改良策略。在这项研究中,我们研究了负载银纳米颗粒的二氧化钛纳米管(Ag@TiO_2-NTs)对巨噬细胞的生物学行为以及局部骨免疫微环境的影响。我们发现对生物材料进行表面修饰能够高效的调控巨噬细胞的生物学行,例如细胞粘附,细胞形态和增殖分化。Ag@TiO_2-NTs能够将巨噬细胞极化成M2型,并营造良好的局部骨免疫微环境。此外,我们还深入研究了生物材料的纳米形貌和巨噬细胞极化之间的潜在机制,发现Ag@TiO_2-NTs具有良好的抗氧化应激能力和活性氧清除能力。由于自噬能够抑制细胞内活性氧和炎症小体的产生,因此我们推测Ag@TiO_2-NTs能够通过激活材料表面巨噬细胞中的保护性自噬,进而清除巨噬细胞内的活性氧以调节巨噬细胞极化,从而产生良好的骨免疫微环境。为了验证我们的设想,我们使用qPCR,western blot和ELISA等实验技术来检测巨噬细胞M1型/M2型的极化状态,如巨噬细胞表型标志物iNOS、TNF-α、ARG、TGF-β以及巨噬细胞内自噬水平的表达如p62、Beclin-1和LC3B。之后,我们使用DC-FHDA探针检测了巨噬细胞中的ROS含量,结果显示在Ag@TiO_2-NTs上生长的巨噬细胞比对照组表达显著增多的M2型标志物(ARG、TGF-β),更少的M1型标志物(iNOS、TNF-α)以及更高的自噬水平和更少的细胞内活性氧含量。为了进一步探索细胞内保护性自噬水平对巨噬细胞极化的影响,我们使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和雷帕霉素(Rapa)来调节巨噬细胞内的自噬水平,并发巨噬细胞内较高的自噬水平倾向于极化成M2型巨噬细胞,同时也抑制了M1型巨噬细胞的极化。然后,我们检测了Ag@TiO_2-NTs在体外和体内构建的骨免疫微环境,我们通过构建体外间接共培养模型,使用不同材料来源的巨噬细胞条件培养基培养成骨前体细胞MC3T3-E1,并使用qPCR观测细胞内表达的成骨基因(Runx2,ALP,OCN和OPG)以及通过茜素红染色和碱性磷酸酶染色观察细胞外基质沉积。为评估其体内成骨效应,我们使用SD大鼠胫骨缺损模型,利用X线和micro-CT检测其骨愈合情况,证明了Ag@TiO_2-NTs能够通过产生骨免疫微环境刺激新骨形成。综上所述,我们的研究表明Ag@TiO_2-NTs能够通过激活细胞内保护性自噬,清除局部不良的氧化应激环境进而调控局部微环境,抑制巨噬细胞向M1型极化,同时促进巨噬细胞极化为M2型,最终营造优异的成骨-免疫微环境。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R68;R318.08
【图文】：

曲线,光电子谱,射线,水接触角

?中科技大学硕士学位论文18三、实验结果3.1 表面表征和 Ag +释放通过阳极氧化在60V下1小时制备的样品的纳米结构和表面表征如图1 所示.Ti，TiO2-NTs 和 Ag@TiO2-NT 的 X 射线光电子能谱图如图 1A所示，表明 Ag 纳米粒子成功地分布在 TiO2-NTs 上。图 1B 显示了Ag@TiO2-NT 在第 1 天（80.2％），3（15.7％），5（1.8％），7（1.38％）和 10（0.9％）的 Ag 离子释放曲线，总 Ag 浓度为 0.2ppm。水接触角（图 1C）是影响生物相容性的重要因素，Ti 为 53.4°

巨噬细胞,鬼笔环肽,活力,扫描电镜

2-NTs 的表面上呈现长梭形。图2C显示了在不同样品表面孵育24h,48h和72h后，RAW 264.7细胞在样品上的细胞活力和增殖情况。第 1d,2d 和 3d，不同表面上的巨噬细胞活力相当，没有显著差异，表明各个样品均无显著细胞毒性。图 2：巨噬细胞形态：扫描电镜（A），鬼笔环肽/ DAPI 染色（B），CCK-8 检测各样品表面巨噬细胞活力(C)3.3 巨噬细胞在不同表面上的极化和自噬相关基因表达将未激活的 M0 型巨噬细胞在不同样品表面上培养 24 小时后，通过免疫荧光染色（LC3B，图 3A 和 3D）、qPCR（图 4）和蛋白质印迹（图 3F）分析与巨噬细胞内自噬相关的基因和蛋白的表达情况。结果表明

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