Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架生物相容性及免疫原性的实验研究

发布时间：2020-06-21 09:15

【摘要】：目的:Scleraxis修饰的hAMSCs能否与人脱细胞羊膜支架(HAAM)复合,并在此基础上验证Scx-hAMSCs-HAAM复合体的生物相容性及免疫原性。方法:1)取人足月剖宫产胎盘的羊膜组织,分别利用酶消法、冻融法制备人脱细胞羊膜支架(HAAM),将两种方法制备好的HAAM进行脱水、石蜡包埋、切片行HE染色后于倒置显微镜下观察,比较不同方法制备HAAM的形态学表现,评估两种方法脱细胞的效果。通过免疫荧光染色,将HAAM置于荧光显微镜下观察细胞移除的情况及经脱细胞处理后人羊膜表面细胞外基质(ECM)丢失的情况。2)同上方法获取人羊膜,经胰酶和胶原酶消化分离得到hAMSCs,纯化、培养、传代,倒置显微镜观察镜下hAMSCs生长及排列的情况,至P3代运用流式细胞术对hAMSCs行表型鉴定,CCK-8检测细胞增殖活性。构建Scx慢病毒载体,通过293T细胞对病毒进行扩增及滴度测定。选取合适滴度转染P3代hAMSCs获得Scx-hAMSCs,利用PCR、Western Blot技术检测Scx基因经转染后在细胞内的表达情况,CCK-8检测转染后细胞活性。3)将Scx-hAMSCs与HAAM共培养,在培养14d时对Scx-hAMSCs细胞进行活细胞染色检测其在HAAM上的生长分布情况,并分别于倒置相差显微镜、扫描电镜(SEM)下观察细胞形态学表现。然后设置空白对照组、阴性对照组、实验组三个分组,将已经制备的HAAM-Scx-hAMSCs置入SD大鼠背部筋膜下,观察一周后处死SD大鼠,取术区组织做HE染色,石蜡包埋、切片,镜下观察各组的免疫排斥反应。结果:1)制备人脱细胞羊膜支架(HAAM)酶消法脱细胞效果比冻融法好,经酶消法脱细胞后HAAM经HE染色可见组织表面光滑,已无法看到任何细胞结构,经免疫荧光染色,可见经酶消法处理后的HAAM细胞表达为阴性,且较脱细胞前的人羊膜(HAM)胶原无明显减少。2)采用胰酶+胶原酶消化HAM可获得大量稳定增殖的hAMSCs,经纯化、培养、传代后细胞形态逐渐呈纺梭形、细胞排列逐渐致密并呈现出螺旋式生长,流式细胞术鉴定P3代hAMSCs后提示间充质干细胞表面标志物CD73(92.1%)、CD105(84.8%)、CD90(94.7%)、CD44(94.1%)高表达,CD19+CD34+CD11b+CD45+HLA-DR(0.3%)呈阴性表达。酶切产物PCR检测在600bp位置显示条带大小,设置不同梯度对293T细胞进行转染,筛选出2×108TU/μL病毒原液,以6μL病毒原液转染P3代hAMSCs,分别于24h、48h后荧光显微镜下观察到细胞中大量荧光表达,提示转染效果良好,PCR检测Scx-hAMSCs转染组Scx基因表达量高于未转染组(*P0.05)。3)将上步骤中制备的Scx-hAMSCs与HAAM进行细胞-支架复合,培养14天后进行免疫荧光染色,荧光显微镜下观察经种植后Scx-hAMSCs已经覆盖HAAM,呈杆形或者纺锤形。HE染色可见相较于阴性对照组,置入Scx-hAMSCs-HAAM(实验组)局部术后1周后术区存在炎症反应,可见浆细胞和中性粒细胞浸润,组织局部可见肉芽组织、新生毛细血管生长,坏死和瘢痕修复并存,炎症反应较阴性对照组重;术后1个月,阴性对照组与实验组,在镜下呈现出炎症消退,实验组可见淡粉色疏松的类似于羊膜的被覆上皮组织包绕局部组织,且已出现细胞贴附生长,表层细胞呈线性紧密排列,可认为细胞-支架复合体植入SD大鼠体内后免疫原性较低。结论:1)利用酶消法处理人羊膜可以获得具有丰富的细胞外基质和良好孔隙率的人脱细胞羊膜支架(HAAM),可作为生物支架为种子细胞的生长繁殖提供条件。2)Scx-hAMSCs-HAAM与HAAM在动物体中短期时间内表现出低免疫原性,有助于组织工程韧带的构建,为其提供了潜在的移植物来源。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08
【图文】：

具有一定的韧性和机械强度。经酶消法处理后，图2B。可见经过胰酶消化后获得的 HAAM，结构变得更加通透，相较于 HAM 变得更薄、容易撕碎，这与间充质细胞的移除和胶原的流失有关系。经冻融法处理后。见图2C，可见人羊膜表面变得僵硬，部分发生皲裂。图 2 肉眼观下人羊膜与分别通过酶消法和冻融法获得的脱细胞羊膜Fig.2 Human amniotic membrane under naked eyes and acellular amniotic membrane obtained byenzyme digestion and freeze-thaw respectively.Note:A: Human amniotic membrane;B：Treatment of human amniotic membrane by enzymeelimination；C：Treatment of human amnion by freeze-thaw method.2.2.1 倒置相差显微镜下观察 HAM 与 HAAM 组织学结构变化采用 HE 染色人新鲜羊膜，见图 3A。倒置相差显微镜下可见人新鲜羊膜中大量上皮细胞呈现串珠状排列于羊膜基底膜表面，其细胞形态呈现圆形或者类圆形，核深染色为紫色；上层深面基底膜结构完整，呈现为深粉色；皮下结缔组织疏松并可见少量细胞（hAMSCs）分布其中，细胞核深染呈紫色。经酶消法处理后，见图 3B。可见经过酶消化后羊膜表面及基底层细胞已经全部被移除，结缔组织排列紊乱，但总体结构仍保持良好。经冻融法处理后，见图 3C

图 3 倒置显微镜下观察 HAM 及分别运用酶消法和冻融法制备的 HAAM 组织结构（HE 染色40×）Fig.3 Observation of HAM under inverted microscope and tissue structure of HAAM prepared byenzyme digestion and freeze-thaw method (HE staining 40 ×).Note:A: Human amniotic membrane of HE stain;B: HE staining of human amniotic membranetreated by enzyme elimination method;C: HE staining of human amniotic membrane after freeze-thaw treatment.2.2.2 荧光显微镜下观察 HAM 与 HAAM 组织学结构变化通过对 HAM 与 HAAM 进行免疫荧光染色（见图 4A、4B），未脱细胞的 HAM 上Collagen Type I 和细胞核 DAPI 染色成阳性表达，而在经过酶消法脱细胞后，见图4C、4D，制备的 HAAM 上 DAPI 染色结果为阴性，提示 HAAM 上细胞已基本移除，Collagen Type I 表达较 HAM 弱，可能与酶消法引起人羊膜胶原丢失有关。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 娄志义;;聚焦“细胞分化”试题[J];生物学教学;2012年02期

2 袁春;细胞分化的若干疑点浅析[J];中学生物教学;2003年Z2期

3 刘建峰;浅谈细胞分化[J];中学生物教学;2004年Z1期

4 马迪;;也许有一天你可以打印自己的心脏[J];今日中国;2017年05期

5 冯汉茹;陶应忠;;《细胞的分化》教学设计及反思[J];中学教学参考;2017年14期

6 江锐;;“细胞分化形成组织”(第一课时)的教学设计[J];新课程(下);2017年04期

7 赵自然;;新鲜空气使干细胞分化[J];基础医学与临床;2010年03期

8 ;CD2相关蛋白在足细胞分化中的作用[J];华中科技大学学报(医学版);2008年04期

9 张传茂;;细胞分化 中国科学家谈科学[J];科学观察;2007年06期

10 张乃群，赵丽英;植物细胞分化的研究综论[J];南都学坛;1996年06期

相关会议论文 前10条

1 叶延;严青然;杜芳;张晓明;鲍春德;;艾拉莫德抑制人B细胞分化功能的体外研究[A];第十一届全国免疫学学术大会分会场交流报告集[C];2016年

2 芦小单;谭岩;方艳秋;刘磊;林秀英;;VEGF对血细胞分化发育的调节[A];第十届全国免疫学学术大会汇编[C];2015年

3 岳文;王冬梅;袁红丰;裴雪涛;;干细胞分化调控新基因的筛选及其功能研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

4 丁建东;;图案化表面与干细胞分化[A];2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——大会邀请报告[C];2013年

5 徐志彦;;《细胞分化》教学案例(教学内容安排1课时)[A];河北省教师教育学会第二届中小学教师教学案例展论文集[C];2013年

6 梁冀;于会梅;傅继东;郭昂;杨黄恬;;内质网钙离子释放受体对干细胞分化的调控[A];中国病理生理学会受体、肿瘤和免疫专业委员会联合学术会议论文汇编[C];2010年

7 司聚同;邢录洲;孙红;陈德高;王永潮;;I_D基因:一个广谱性细胞分化抑制基因[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年

8 项盈;金洁;沈丹;郑强;谢纯刚;贾冰冰;黄国平;王金福;;复苏的人骨髓间充质干细胞的分离、培养及向多系细胞分化的诱导[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

9 姜朋飞;毛峥伟;高长有;;水凝胶模量和化学性质共同影响干细胞分化的研究[A];2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——主题I：生物高分子与天然高分子[C];2013年

10 李靖;白祝洽;;肺泡Ⅱ型上皮细胞分化中的力学调控[A];第十二届全国生物力学学术会议暨第十四届全国生物流变学学术会议会议论文摘要汇编[C];2018年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者 张建列 通讯员 黄博纯;中国科学家揭示干细胞分化新机制[N];广东科技报;2017年

2 记者 卢鹰;我国干细胞临床转化取得多项突破[N];经济参考报;2017年

3 ;大脑“后勤”细胞参与指挥神经元发育[N];科技日报;2017年

4 李伟;中英合作研究中药调控干细胞分化机理[N];医药经济报;2009年

5 陈超;科学家发现引发细胞分化的分子通道[N];科技日报;2010年

6 章静波;干细胞及其巨大的医学潜势[N];人民政协报;2000年

7 ;美试验用肿瘤细胞治中风[N];新华每日电讯;2000年

8 陈丹;美将干细胞分化成内耳毛发细胞[N];科技日报;2003年

9 记者 施嘉奇　通讯员 王姿英;探索中药对干细胞分化的作用[N];文汇报;2009年

10 张佳星;干细胞分化路径存在差异性[N];中国矿业报;2008年

相关博士学位论文 前10条

1 高骥;miRNA-142-3p调控诱导型调节性T细胞功能和凋亡的作用机制研究[D];南京医科大学;2019年

2 刘芸;细胞穿透肽原核表达文库的分析以及高丰度穿透肽的机制和功能研究[D];南方医科大学;2013年

3 蒋丽丽;ACS患者外周血CD4+Foxp3+Helios+调节性T细胞下调及其机制研究[D];华中科技大学;2017年

4 孙晓萱;脂联素调控CIA小鼠Th17细胞分化及其机制的研究[D];南京医科大学;2016年

5 王晓慧;E2a在小鼠抗肾小球基底膜肾炎中的表达及免疫相关性研究[D];武汉大学;2015年

6 简文静;标记蛋白IGF2BP3调控miR9-TGF-βR1/smads轴诱导HRS细胞再分化机制研究[D];南方医科大学;2015年

7 吴金霞;依赖p53的基因Rap2a在肿瘤细胞迁移侵袭中的作用研究[D];南京医科大学;2014年

8 李玉梅;Escargot和Scute调控肠道内分泌细胞分化的机制研究[D];清华大学;2017年

9 尹盛夏;Runx3参与的固有淋巴细胞Group1 ILC和NCR~+ILC3对胞内菌感染的限制作用及其机制探究[D];浙江大学;2018年

10 陆中杰;去细胞肝脏支架诱导T细胞凋亡抑制T细胞激活[D];浙江大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 何惠敏;基于转瓶生物反应器制备细胞聚团应用于软骨组织再生的研究[D];华东理工大学;2019年

2 杨灿;PIM2在人类红系发育中的功能研究[D];郑州大学;2019年

3 郑中龙;食管鳞癌细胞培养上清液对正常CD3~+CD56~+NKT细胞亚型、表面受体及效应分子表达的影响[D];西南医科大学;2019年

4 徐志;Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架生物相容性及免疫原性的实验研究[D];遵义医科大学;2019年

5 银Z^芷;FOXP3抑制PMA/ionomycin刺激下p65介导的THEMIS转录调控[D];厦门大学;2018年

6 崔曼瑜;Lamtor1调节外周T细胞的增殖和活化[D];厦门大学;2018年

7 郇文彬;钩吻素子对不同种属细胞的作用及抗肿瘤活性的研究[D];南京农业大学;2017年

8 林达辉;Jarid2调节滤泡辅助型T细胞的功能及免疫应答[D];厦门大学;2017年

9 张焕荣;PHLPP调节B细胞的增殖和分化[D];厦门大学;2017年

10 方源;Gasdermin D-N端片段在细胞焦亡时寡聚并迁移上细胞质膜[D];厦门大学;2017年

本文编号：2723854