新型3D打印含铜钴基合金的生物相容性及其生物功能作用研究

发布时间：2020-06-21 00:15

【摘要】：目的:本研究的目的是在现有医用钴基合金材料中加入铜元素,使用3D打印工艺中的选择性激光熔融技术(selected laser melting,SLM)制得一种新型含铜钴基合金并探究其生物相容性以及其生物功能化作用。材料与方法:以3D打印技术制得的两种新型含铜钴基合金(混粉含铜钴基合金,合金粉含铜钴基合金)作为实验组,以3D打印技术制得的不含铜元素的常规医用钴基合金作为对照组。将实验材料与人牙周膜成纤维细胞(Periodontalliga-ment fibroblast,PDLF)小鼠胚胎成骨细胞(Mouse pre-osteoblastic cells,MC3T3-E1)以及人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)分别与材料进行共培养后,使用细胞增殖活力测定(CCK-8法)、实时无标记细胞分析技术(Real time cellular analysis,RTCA)、细胞毒性测定实验、鬼笔环肽细胞染色实验、细胞流式实验来检测材料对细胞增殖、细胞凋亡、细胞黏附的影响,评价新型含铜钴基合金的生物相容性。使用HUVEC细胞进行Transwell迁移实验,细胞成小管实验以及聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术测定相关促血管化基因表达来检测材料对细胞迁移的影响,评价新型含铜钴基合金的促血管化能力。使用MC3T3-E1细胞与材料共培养后进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性检测实验,茜素红染色实验以及使用PCR技术测定相关促成骨基因表达情况,评价其促成骨能力。最终综合评定新型含铜钴基合金的生物相容性以及生物功能作用。结果1.CCK-8试验结果表明,新型3D打印含铜钴基合金材料与PDLF、HUVEC以及MC3T3-E1细胞分别进行共培养1、3、7天后其细胞增殖率均大于75%,属于1级细胞毒性。2.RTCA实验结果表明,使用新型3D打印含铜钴基合金浸提培养液分别培养PDLF、HUVEC以及MC3T3-E1细胞120小时后,三种细胞均生长良好,细胞生长曲线没有发生阻滞或下降等状况,实验组与对照组生长曲线基本一致。3.细胞凋亡实验结果表明,将新型3D打印含铜钴基合金材料与PDLF、HUVEC以及MC3T3-E1细胞分别进行共培养1、3天后,实验组与对照组细胞凋亡率无显著性差异。4.使用鬼笔环肽对黏附在新型3D打印含铜钴基合金材料上4小时及24小时的PDLF、HUVEC以及MC3T3-E1细胞染色后,我们可以在显微镜下观察到各组细胞在各个时间点上细胞生长及铺展情况彼此相似,未见显著性差异。5.Transwell迁移实验结果显示,两个实验组细胞迁移数量均高于对照组细胞迁移数量,但实验组与对照组间不存在显著性差异(P0.05)。6.成小管实验结果显示,实验组在形成的小管数量及长度上均显著高于对照组(P0.05)。7.PCR测定成小管相关基因表达情况的实验结果表明,相较于对照组,实验组细胞相关成小管基因表达情况明显高于对照组(P0.05)。8.ALP活性检测结果表明,合金粉含铜钴基合金组与对照组常规医用钴基合金共培养的细胞在ALP活性上并无显著性差异,但合金粉含铜钴基合金组ALP活性明显高于混粉含铜钴基合金组。9.茜素红染色实验表明,合金粉含铜钴基合金组其钙结节生成量略高于对照组及混粉含铜钴基合金组,但不具有显著性差异(P0.05)。10.PCR测定促成骨相关基因表达情况的实验结果表明,合金粉含铜钴基合金的促成骨相关基因表达情况显著高于混粉含铜钴基合金实验组(P0.05),但是合金粉含铜钴基合金实验组与对照组常规医用含铜钴基合金的促成骨相关基因表达情况不存在显著性差异(P0.05)。结论1.新型3D打印含铜钴基合金材料相较于常规应用的医用钴基合金材料对PDLF、HUVEC以及MC3T3-E1细胞无任何明显细胞毒性,所有检测指标均满足生物医用材料使用标准。2.相较于常规使用的医用钴基合金,含铜钴基合金具有显著的促血管化作用。3.相较于常规使用的医用钴基合金,含铜钴基合金的促成骨作用并不明显,但是合金粉含铜钴基合金促成骨效果明显好于混粉含铜钴基合金。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R783.1
【图文】：

中国医科大学硕士学位论文3 结果LF 细胞的生物相容性实验结果1. CCK-8 细胞增殖活力测定结果 1分别为 PDLF细胞与不同材料共培养1、3和7天后的 OD值。由料随着培养天数的增加，OD 值逐渐增大，说明细胞增殖良好。两材料的 OD 值和阴性对照组相比几乎无差别，不存在显著性差异。金材料之间也不存在显著性差异。如表 3所示，两种含铜钴基合金率（RGR 值）均＞99%，其结果远远大于 75%的 1 级细胞毒性要求毒性，说明相对于常规使用的医用钴基合金材料，新型医用含铜具有细胞毒性。满足植入材料对细胞毒性的要求。

3.1.2. RTCA 实时监测曲线的比较图 2为 PDLF细胞使用不同材料浸提液培养 140小时后的 Cell Index（CI）值曲线。从接种期时段（最初将 PDLF 接种到 E-Plate 的 24 小时）的各个细胞曲线来看，各孔的细胞生长良好，体现在细胞曲线随着培养时间的延长，细胞曲线不断上升，无明显停滞和下降的情况发生，各组间无明显差异。生长增殖时段（浸提液培养阶段，24H开始直到结束）内细胞的培养液换成相应材料的浸提液，换液后我们可以看到各孔的细胞仍然生长良好，体现在细胞曲线仍然随着培养时间的延长，且细胞曲线不断上升，各组间无明显停滞和下降的情况发生，各组间也无明显差异。这就表明直到试验结束的整个培养过程中各组 PDLF 细胞均生长状况良好。三组材料间无显着差异，说明本材料浸提液中的成分在整个细胞生长繁殖过程中不会抑制细胞增殖或对细胞产生细胞毒性。

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本文编号：2723183