应用猪小肠黏膜下层复合支架构建小口径人工血管的实验研究
发布时间：2020-06-21 22:45
【摘要】：目的:在心血管外科领域,膨体聚四氟乙烯(expanded polytetrafluoroethylene,ePTFE)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)在临床上常用于重建大动脉。然而,这些合成材料制作的人工血管,用于小口径动脉(内径≤6mm,如冠状动脉或下肢动脉旁路移植)重建时临床结局很不理想,组织相容性差,在血管腔形成血栓、内膜过度增生或感染易导致人工血管管腔闭塞。对于这样的小动脉旁路移植术,自体动脉(如胸廓内动脉和桡动脉)或静脉(如大隐静脉)仍然是最理想的血管替代物。但是,通常由于自体血管质量低劣或数量不足,来源有限,不能够总是轻易获取。小口径动脉的人工血管替代物是多年研究的热点和难点。采用自体血管壁细胞作为种子细胞进行人工血管培育或种植的方法,取得过一些成果,但缺点也很明显,自体细胞的获取是创伤性的,自体细胞预处理、种植或生物反应器培养的程序比较繁琐,周期长,人工血管也非常容易感染。如今,日益增长的心血管问题更多的需要现成的小口径人工血管,而不需要从患者身上获取组织或细胞,因此,研发新型适应临床需求的小口径人工血管很有必要。在本研究中,我们基于可生物降解的猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)与可得然(curdlan)胶和双嘧达莫(dipyridamole,DIP)混合膜作为夹心的“三明治”,成功设计制作了复合的“三明治”夹心小口径人工血管。本研究的目的是检测该人工血管体外的生物学性能、研究移植到兔颈总动脉的通畅和重构情况,以及调控影响复合小口径人工血管内皮化及内膜增生的机制及临床应用前景初探。研究方法:按照Abraham的方法制备SIS并脱细胞和消毒处理,使用交联剂1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDC)对SIS进行肝素涂层。对肝素与SIS结合的体外释放率进行了测试。Curdlan胶作为DIP载体。不同浓度的curdlan胶和DIP混合膜作为夹心,制作双层SIS的“三明治”,体外测试了DIP的释放率,血小板(platelet,PLT)黏附实验,溶血实验,人工材料对血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)及血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的增殖率影响及毒性实验。制作了三种类型的人工血管(2mm内径,长度20 mm):10%curdlan胶和10%DIP混合膜作为夹心的“三明治”双层SIS人工血管(SIS curdlan DIP,SCD),10%curdlan胶膜作为夹心的“三明治”双层SIS人工血管(SIS curdlan,SC),单层SIS人工血管(SIS,S),体外测试人工血管的力学性能,人工血管被分别旁路移植到兔子颈总动脉(native carotid artery,NCA)并饲养2~3个月,未手术兔的NCA作为对照组,每组16只兔子。多普勒超声及CT随访观察人工血管的通畅情况,取材后从大体外观、内膜电镜扫描、胶原及弹力纤维定性及定量分析、形态学、免疫荧光及蛋白免疫印迹来评价人工血管的体内重构特性。并通过细胞周期及信号通路检测的方法对调控影响复合小口径人工血管内皮化及内膜增生的机制进行了研究。结果:SIS经HE染色,脱细胞前黏膜层侧比较光滑,肌层侧比较粗糙,可见细胞核。脱细胞后的SIS黏膜层侧变化不大,并且细胞核消失,说明脱细胞比较充分。扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察显示脱细胞后肌层侧变得更为疏松,形成孔径介于20~200微米的三维空间网状结构。肝素与SIS结合后,第一个24小时释放(18.5±3.5)%,此后体外20天的释放曲线比较平缓,逐渐释放共达(94.3±2.4)%,说明肝素通过交联结合比较牢靠。通过检测荧光强度定量测定结果表明,经过91天的体外释放测试,SIS+10%curdlan+10%DIP“三明治”材料中DIP共释放了(21.8±6.2)%,明显低于SIS+2.5%curdlan+10%DIP的(67.5±7.2)%和SIS+5%curdlan+10%DIP的(49.4±9.5)%。取材的SCD人工血管的DIP释放量:2-mo大约释放(53.39±3.52)%,3-mo释放达到(91.01±4.79)%。PLT黏附实验显示,未交联肝素的SIS的PLT黏附率比较高,PLT保留指数%PRI=(59.2±6.7)%,交联肝素后%PRI=(11.2±2.4)%,“三明治”SIS+10%curdlan%PRI=(9.5±2.7)%,“三明治”SIS+10%curdlan+10%DIP的%PRI=(3.3±0.6)%。溶血实验显示所有材料的溶血率都低于5%。MTT实验显示随着DIP浓度加大,对于VSMCs增殖的抑制越强,小于等于10%DIP夹心的材料对于ECs增殖有促进作用。机械性能测试显示SCD,SC的爆破压优于S组。人工血管植入后,闭塞的和其余的随机共占各组一半的实验兔(每组8例)在2个月处死,其余的饲养到3个月。随访多普勒显示8例SCD在2个月都通畅,6/16(37.5%)的SC人工血管和5/16(31.25%)的S人工血管在2个月闭塞。这些取材的移植物组织学分析免疫荧光技术显示,所有通畅人工血管存在显著宿主细胞浸润和不同程度的ECs覆盖。SC和S人工血管的闭塞是由于血栓形成。在3个月,1例SCD闭塞,通畅的SCD表现为融合和有功能的内皮,无内膜过度增生,并且新生内膜层包含沿圆周排列的VSMCs,SC和S人工血管显示不完全内皮化和不同程度的内膜附壁血栓,SC人工血管闭塞(3/8)、S人工血管闭塞(2/8)。3个月SCD人工血管取材的胶原蛋白定性及定量分析显示胶原所占比例接近于兔颈总动脉,而各组弹性蛋白所占比例均小于兔颈总动脉,并且没有纤维弹性蛋白形成的证据,说明组织重构尚不完全。蛋白免疫印迹研究结果表明,SCD的eNOS表达高于SC及S,α-SMA及MYH表达低于SC及S,说明DIP具备促进内皮化及抑制VSMCs过度增生的作用。细胞周期检测显示DIP能够增加ECs的G2和S期比例,同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)使ECs增殖停滞于G1期,DIP能够部分逆转Hcy对于ECs细胞周期的影响。与之相反的是,Hcy能够增加VSMCs的G2和S期比例,DIP使VSMCs增殖停滞于G1期,DIP能够部分逆转Hcy对于VSMCs细胞周期的影响。Hcy及DIP和不同阻断剂干预会导致影响HUVECs功能cAMP依赖的信号通路产生变化,Hcy及DIP和不同阻断剂干预会导致影响HASMCs增殖cAMP依赖的信号通路产生变化。结论:体外研究表明,新鲜取材的SIS经过一系列的脱细胞和消毒处理程序,在EDC辅助下实现了肝素交联和缓释,以10%curdlan+10%DIP混合膜作为双层SIS“三明治”夹心的复合小口径人工血管,具备良好生物机械性能、血液相容性和ECs相容性,同时能够抑制VSMCs的增殖,DIP以curdlan作为载体,能够达到长期缓释的目的。动物实验结果表明,交联肝素,以及curdlan凝胶负载DIP的药物缓释系统作为人工血管“三明治”夹心,提高了抗PLT黏附性能,有效的预防了血栓形成。DIP抑制了人工血管内膜的过度增生并促进了早期内皮化。信号通路研究显示,DIP可以通过cAMP依赖的PKA-RhoA、Epac-PI3K通路共同逆转Hcy诱导的HUVECs功能障碍。DIP可以通过cAMP依赖的PKA、Epac-MEK通路共同抑制Hcy诱导的HASMCs增生。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R654;R318.1
【图文】：
图 1.1 SIS 的获取及脱细胞过程。素交联到 SIS 及肝素释放率实现肝素化，SIS 片浸入 pH为1.5 的50ml 2（-N-吗啉）乙磺酸缓冲物技术有限公司，中国），包含 20mM 的 N-羟基琥珀酰亚胺（N试剂，中国），20mM 的 EDC（麦克林，中国），和肝素钠（千红00 U，100mg），然后在 37℃轻轻搅拌 36h。肝素通过 SIS 表面 NH为了中和反应并除去未结合的肝素，SIS 在 PBS 中轻柔漂洗。通解的肝素浓度与初始浓度比较，确定固定在 SIS 上的肝素量。苯胺蓝法测定 SIS 释放肝素的量。肝素化的 SIS 浸泡于 50ml PBSl 上清液，再往 50ml PBS 的试管中添加 2.5ml 新的 PBS，上清液与0.005 wt％)混合，室温 1 分钟。用 5ml 己烷（沪试，中国）萃取甲合物。反应在离心前 30 分钟进行。然后由多功能酶标仪 (Thermo 下面的水溶液在 631 nm 处的吸光度（一个空的背景吸光度从每个值
图 1.2 肝素交联到 SIS 所用试剂，原理，肝素释放率测定酶标仪。2.2.3 Curdlan 和 DIP 混合膜，复合支架的构建在常温下，curdlan（货号 C7821-5G，Sigma-Aldrich）和 DIP（货号 D9766-5G，Sigma-Aldrich，美国）不溶于水。因此，均质机(DragonLab OS40-Pro，中国)1500转 30 分钟被用来生产分散的 curdlan 和 DIP 悬浮液。细胞附着的鉴定及 ECs 和VSMCs 的 MTT 法检测时，curdlan 的浓度为 10%，curdlan 和 DIP 的混悬液中，DIP的浓度依次为 0、2.5、5、10%（w/v）。检测在不同浓度的 curdlan 胶中 DIP 的释放率，curdlan 浓度分别为 2.5、5, 10%（w/v），DIP 的浓度为 10%。在玻璃皿中，计算复合悬浮液的体积和玻璃皿底面积，均匀分散混悬液，加热超过 80℃ 20 分钟，制得 200μm 厚的 curdlan 和 DIP 混合膜。该膜被切割成合适的大小（9×9mm），作为 1cm2双层 SIS“三明治”的夹心。SIS的黏膜侧面向外侧。复合支架的开口边缘用 8-0 Prolene 线连续缝合关闭(Johnson &Johnson, 美国)。见图 1.3。单层 SIS 或 10%curdlan 负载浓度梯度 DIP 的复合材料，
本文编号：2724761
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R654;R318.1
【图文】：
图 1.1 SIS 的获取及脱细胞过程。素交联到 SIS 及肝素释放率实现肝素化，SIS 片浸入 pH为1.5 的50ml 2（-N-吗啉）乙磺酸缓冲物技术有限公司，中国），包含 20mM 的 N-羟基琥珀酰亚胺（N试剂，中国），20mM 的 EDC（麦克林，中国），和肝素钠（千红00 U，100mg），然后在 37℃轻轻搅拌 36h。肝素通过 SIS 表面 NH为了中和反应并除去未结合的肝素，SIS 在 PBS 中轻柔漂洗。通解的肝素浓度与初始浓度比较，确定固定在 SIS 上的肝素量。苯胺蓝法测定 SIS 释放肝素的量。肝素化的 SIS 浸泡于 50ml PBSl 上清液，再往 50ml PBS 的试管中添加 2.5ml 新的 PBS，上清液与0.005 wt％)混合，室温 1 分钟。用 5ml 己烷（沪试，中国）萃取甲合物。反应在离心前 30 分钟进行。然后由多功能酶标仪 (Thermo 下面的水溶液在 631 nm 处的吸光度（一个空的背景吸光度从每个值
图 1.2 肝素交联到 SIS 所用试剂，原理，肝素释放率测定酶标仪。2.2.3 Curdlan 和 DIP 混合膜，复合支架的构建在常温下，curdlan（货号 C7821-5G，Sigma-Aldrich）和 DIP（货号 D9766-5G，Sigma-Aldrich，美国）不溶于水。因此，均质机(DragonLab OS40-Pro，中国)1500转 30 分钟被用来生产分散的 curdlan 和 DIP 悬浮液。细胞附着的鉴定及 ECs 和VSMCs 的 MTT 法检测时，curdlan 的浓度为 10%，curdlan 和 DIP 的混悬液中，DIP的浓度依次为 0、2.5、5、10%（w/v）。检测在不同浓度的 curdlan 胶中 DIP 的释放率，curdlan 浓度分别为 2.5、5, 10%（w/v），DIP 的浓度为 10%。在玻璃皿中，计算复合悬浮液的体积和玻璃皿底面积，均匀分散混悬液，加热超过 80℃ 20 分钟，制得 200μm 厚的 curdlan 和 DIP 混合膜。该膜被切割成合适的大小（9×9mm），作为 1cm2双层 SIS“三明治”的夹心。SIS的黏膜侧面向外侧。复合支架的开口边缘用 8-0 Prolene 线连续缝合关闭(Johnson &Johnson, 美国)。见图 1.3。单层 SIS 或 10%curdlan 负载浓度梯度 DIP 的复合材料，
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 孙秀娟;范代娣;朱晨辉;马晓轩;骆艳娥;陈岚;郭佳庆;;类人胶原蛋白-透明质酸血管支架的性能及生物相容性[J];生物工程学报;2009年04期
本文编号：2724761
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