磷酸三钙植入材料微结构对Wnt非经典信号通路调控的研究

发布时间：2020-06-30 20:46

【摘要】：目的:利用H_2O_2发泡及控制烧结温度合成具有不同微结构的TCP陶瓷材料并且探讨不同微结构TCP材料对Wnt非经典信号通路中相关标志物表达水平的影响。方法:1、配制磷酸三钙浆料并通过双氧水发泡完成素胚制作,将经模具成型的素坯置于1080℃和1000℃下烧结成瓷,获得不同微结构的TCP材料并用Co60消毒。2、XRD实验验证制备成型的陶瓷材料块的化学成分3、SEM扫描确定制备材料的表面形貌及颗粒大小。4、压汞实验测定材料的内部结构,包括孔径大小、孔隙率、迂曲度等。5、MG63细胞与不同微结构的TCP材料共培养,并以培养板为空白对照,利用q-PCR技术检测各组在共培养3、5、7天后Wnt5a、Wnt11、ROR2、FZD1、DKK1表达水平。结果:1、XRD检测结果:实验中制备的三组可植入陶瓷材料的化学成分为β-TCP(图3-1)。2、SEM实验:扫描电镜下观察TCP-compact表面孔隙较小,数目少;TCP-middle和TCP-big表面粗糙,可见明显的沟壑形态(图3-2)。3、MIP实验:TCP-compact的孔隙率约34.11±1.04%,孔隙大小约0.96±0.04μm;TCP-middle的孔隙率与TCP-big相差不大,但是孔径大小有差别意义,分别为6.51±0.30μm、10.41±0.67μm。(表3-3)。4、Wnt5a的表达:具有微孔结构材料中Wnt5a表达水平显著上升(P0.05),微孔孔径较大的材料中表达水平最高;在共培养的后期材料组与对照组没有差异(P0.05)。5、Wnt11的表达:TCP-middle组与Control组相比,Wnt11的表达处于低水平(P0.05),后期这种低水平的表达状态有所缓解但仍低于对照组;TCP-middle组虽初期处于抑制,然而后期也表现出轻度促进;TCP-big则表现较早的摆脱抑制状态,在第5天即表现为促进;同时不同时间点也可观察到材料组之间的表达水平是有差异的(P0.05)。6、ROR2的表达:TCP-compact与Control组比较呈现低水平ROR2表达(P0.05);具有微孔结构材料则表现为初期即有差异但不明显,第5天时则明显增加(P0.05),并且与TCP-big共培养的细胞在促进ROR2表达时更具有效果(P0.05)。7、FZD1的表达:初始时FZD1在TCP材料中相对Control组表达量较低;第5天时具有微孔结构的材料则表达量增加(P0.05),并且孔径较大的微孔材料对FZD1的表达具有更积极意义。8、DKK1的表达:材料组中DKK1表达与Control比较表现为具有微结构表面的材料促进而TCP-compact抑制;TCP-middle在早期明显促进DKK1表达,随时间这种影响减弱并且幅度较大;TCP-big组的表现与TCP-middle组类似,但是区别在于变化幅度较小。共培养第7天,材料组表达无明显差异(P0.05)。结论:通过H2O2发泡及控制烧结温度制备出具有不同微结构的TCP材料,进一步研究证实不同微结构的TCP材料与MG63细胞共培养显示材料影响Wnt非经典信号通路的表达水平,其相关标志蛋白表达水平的差异为材料微孔结构所调控,在一定范围内材料孔径越大Wnt非经典信号通路则被明显促进。具有微孔结构的TCP材料可以通过促进Wnt非经典信号通路的表达进而启动骨诱导的发生。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R783.1
【图文】：

流程图,材料制备,流程图,完全培养基

TCP 材料制备流程图2.2.2 MG63 细胞体外培养MG63 细胞完全培养基配置：将购买的 HDMEM培养基用 50ml 离心管分装，加入体积分数 10%的 FBS 和 1%双抗溶液（青霉素及链霉素）配制完全培养基。配置完成后存放于 4℃冰箱进行短期保存，保存期限不得超过一个月，使用前放在 37℃水浴箱中孵育 15min。MG63 细胞的复苏及培养：从-150℃冰箱复苏取出冻存的 MG63 细胞株，迅速放置入已预热的至 37℃的水浴箱中溶解，轻轻晃动冻存管使快速解冻，避免水没过瓶盖以及避免溶解时间过长。待解冻后低速离心机离心（1000rpm/min，5min），然后移入已消毒的生物安全柜内弃置上清并加入适量的完全培养基，混匀后转移至 25cm2的培养瓶，再加入 3ml 培养基，使培养基均匀铺于瓶底。将装有细胞的培养瓶放在 37℃、5%的 CO2恒温培养箱培养。MG63 细胞的传代：在 37℃、5%的 CO2恒温培养箱培养中，体外培养 MG63细胞，每隔 1 天更换完全培养基。每天观察细胞的生长状态，待细胞粘附生长

β-磷酸三钙,化学成分

第 3 章结果第 3 章结果3.1 TCP 植入材料的制备TCP 植入材料的微结构可能在决定骨诱导发生方面起着关键作用[20]，Habibovic 等[40]研究发现不同温度下烧结的羟基磷灰石陶瓷材料其微孔孔径随温度改变而差异较明显。本实验依据课题组前期的技术及经验积累，通过在控制烧结温度在 1000℃和 1080℃以及调控 H2O2发泡作用制备出具有不同微结构的TCP 材料——致密型（TCP-compact）、中等孔径型（TCP-middle），大孔径型（TCP-big）。对该三种材料进行 X 射线衍射实验检测，显示本课题组制备的TCP-compact、TCP-middle、TCP-big 具有相同的化学成分，同时与标准卡片对比，明确其化学成分均为纯β-磷酸三钙（如图 3-1、3-2、3-3）。

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