基于明胶微球的支架作为MC3T3-E1递送载体在骨组织工程中的应用研究

发布时间：2020-07-01 08:30

【摘要】：颅骨缺损是颅脑外伤、外科手术后常见并发症,影响患者身心健康。目前,临床应用的颅骨缺损的修复材料包括:自体骨、同种异体骨、异种骨、金属材料、其他等。其中,自体骨和同种异体骨仍被认为是最理想的骨移植材料,同时也被称为骨移植的“金标准”。但是,这些修复材料由于来源有限、造成供体继发损害、免疫排斥反应、制造成本高及塑形困难等缺陷均不理想。近年来,再生医学和组织工程的迅速发展为组织修复提供了新的方向。组织工程材料主要分为天然材料,合成材料,生物活性陶瓷材料三类,其中,天然材料在组织工程中应用广泛。明胶是天然材料的一种,来源广泛、价格低廉、理化性能可塑性强、良好的生物相容性、生物可降解性、亲细胞性及可注射性等优点,成为近年研究的热点。目的骨组织工程的主要挑战之一是探索理想的细胞递送载体。本研究探索了共价交联明胶微球(ccG-MSs)作为骨组织工程支架,用MC3T3-E1作为模型细胞,在共培养后,共价交联明胶微球支架作为细胞递送载体的可行性。方法油包水单乳液法制备明胶微球,EDC交联明胶微球,化学交联法制备具有光交联性质的多孔凝胶支架前体甲基丙烯酸酐化明胶(Gel-MA)。构建MC3T3-E1/明胶微球支架复合体以及MC3T3-E1/多孔凝胶支架复合体,体外增殖和成骨诱导培养。倒置相差显微镜下观察明胶微球结构、检测明胶微球粒径分布及体外降解情况,核磁共振氢谱(~1H MR)检测甲基丙烯酸酐化明胶交联效果。应用活/死细胞荧光染色法检测细胞增殖活力,HE染色检测MC3T3-E1在明胶水凝胶支架中的生长情况,茜素红染色、Ⅰ型胶原蛋白(Col1)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(Ocn)免疫荧光染色检测及ALP和钙定量检测评估MC3T3-E1在支架中成骨的效果。结果制得的明胶微球,外观圆整、分散性好、粒径分布集中。EDC共价交联明胶微球化学性质相对稳定。甲基丙烯酸酐化明胶在紫外光照射下交联良好。MC3T3-E1可以粘附于明胶微球支架,伸展良好,增殖活跃,与相应的MCG组相比,ccG-MSs构建体内MC3T3-E1细胞比封装在MCG中的MC3T3-E1细胞表现出更高的细胞活力和增殖活性。ccG-MSs构建体可为MC3T3-E1增殖和分化提供更好的细胞微环境。此外,ccG-MSs组比MCG组产生更多的钙结节,且Ⅰ型胶原蛋白(Col1)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(Ocn)表达也强于MCG组。结论共价交联明胶微球支架具有良好的细胞相容性及诱导成骨分化的能力,可以作为细胞递送载体应用于骨组织工程支架,有望成为一种新型的骨组织工程支架以及颅骨缺损修复材料,为骨组织工程的发展奠定基础。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08;R651.15
【图文】：

皮下埋植,细胞支架,裸鼠,明胶微球

子内微球的直径（4） Excel 做出明胶微球粒径分布直方图1.4 明胶微球降解1.4.1 实验试剂和仪器叠氮化钠，国药集团化学试剂有限公司1.4.2 实验步骤（1）取充分干燥的交联后明胶微球，直径范围为 100-300 μm（2）称取质量为 W0的微球置于 15 mL 离心管中，加入 10 mL 含有 0.05％叠氮化钠的 PBS 溶液，平行设置 15 支管，置于 37℃进行体外降解实验（3）分别于第 1 周、第 2 周、第 3 周、第 4 周、第 5 周、第 6 周后取出 3 支管，用双蒸水洗涤 3 次。离心，弃上清。60℃烘箱过夜

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图 2 A 甲基丙烯酸酐化明胶合成原理 B 合成 Gel-MA 的1H NMR 光谱 C 冷冻干燥后甲基丙烯酸酐化明胶（Gel-MA） D 紫外交联成胶后甲基丙烯酸酐化明胶2.2 明胶微球表征应用油包水单乳液法制备得到的明胶微球完全干燥后肉眼观如图 3A 所示，微球分散，少有黏连，粒径相对均匀。显微镜下观察微球如图 3B，微球呈淡黄色，微球之间分散性好，微球的表面相对光滑呈球形。经过灭菌处理溶胀后（使用前）的微球显微镜下如图 3C 所示。本次测量记录了 185 个溶胀后微球的粒径数据，微球直径数据频率分布直方图如图 3D。微球直径分布在 250~700 μm 之间，微球直径在 350~600 μm 之间集中。共价交联明胶微球降解曲线如图 3E,在第 7 天微球质量损失 5.1%，28 天之后微球质量损失 22.9%，42 天之后微球质量损失 40.8%。共价交联之后明胶微球性质相对稳定。

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