基于细胞膜片技术构建组织工程真皮的体外研究

发布时间：2020-07-10 00:01

【摘要】：目的:皮肤的大面积缺损往往因自体供皮不足问题难以完全愈合。本研究旨在探索应用细胞膜片技术构建组织工程真皮的新策略,为皮肤创面的修复和愈合提供新思路。方法:(1)运用全骨髓贴壁法获得rBMSCs(rabbit Bone marrow mesenchymal stem cells rBMSCs),复苏扩增培养HUVECs(Human umbilical vein endothelial cells HUVECs)、HDFs(Human dermal fibroblasts HDFs),倒置相差显微镜下观察种子细胞的形态与生长状态。(2)取P2代rBMSCs,以9×10~4cell/cm~2的密度接种于六孔板内;HDFs在相同条件下培养;两种细胞连续培养14天收获单层细胞膜片,以5×10~4cell/cm~2的密度将HUVECs均匀接种于所获得的未分化rBMSCs膜片上,形成预血管化细胞膜片。在培养的1、3、7、14天,镜下观察膜片的微观形貌,HE染色、CD31免疫荧光染色观察细胞的分布及微血管网络生成情况;对所构建的成纤维细胞膜片镜下观察、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫组化染色,评估细胞的分布及胶原的表达。(3)三维预血管化真皮样组织的构建:将培养7天的预血管化细胞膜片,夹在两层成纤维细胞膜片中间,构成“三明治”样结构,之后再使用镊子对折两次,形成一个拥有12层膜片结构的三维真皮样组织,将未分化的rBMSCs膜片夹在两层成纤维细胞膜片中间叠加后折叠作为对照组。两组均培养24h后进行组织学染色、免疫荧光染色、免疫组织化学染色。结果:(1)利用全骨髓贴壁法获得的rBMSCs拥有良好的分裂增殖能力,镜下呈不规则形、多角形。HUVECs细胞形态呈卵圆形,铺路石样。HDFs细胞形态呈长梭形。三种细胞均于培养皿底壁呈漩涡状生长。(2)HUVECs接种于未分化rBMSCs膜片上,3天即可观察到HUVECs在膜片表面形成的空泡状结构;HDFs膜片上Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原均呈阳性表达。(3)所构建的三维真皮样组织,实验组见“蜂巢”状网络连接结构,实验组与对照组在Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达量上没有显著差异。结论:(1)利用全骨髓贴壁法可获得rBMSCs,传代2次纯化后可用于实验,HUVECs和HDFs细胞生长状态良好。(2)将HUVECs以一定密度均匀接种至未分化的rBMSCs膜片上,能够于体外形成预血管化细胞膜片;所构建的成纤维细胞膜片具有合成和分泌真皮组织中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的能力。(3)有HUVECs参与的三维真皮样组织的基质分布规律更为有序;所构建的预血管化真皮样组织短期内未见因网络血管的形成而明显影响胶原的表达。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318
【图文】：

相差显微镜,细胞形态,细胞

余大多数细胞呈圆形悬浮于培养液内。培养 48h 后，底壁可见大量贴壁细胞生长，数量明显增多，不均匀铺于瓶底。72h 后，贴壁细胞分裂增殖明显，细胞以多角形、长梭形多见（图1a）。培养原代细胞至5-6天时，可见细胞于底壁融合80%-90%，部分视野可见细胞叠层生长，此时进行传代培养，传代过后的细胞 12h 即可贴壁伸展，此时悬浮细胞明显减少，rBMSCs 大多为长梭形均匀贴于底壁。第 1 代细胞经过 1-2 次换液即可铺满瓶底，呈漩涡状生长（图 1b）。图 1 倒置相差显微镜下 rBMSCs 的细胞形态（a）rBMSCs P0（b）rBMSCs P1（Scale bar=100μm）3.3.2 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养形态观察

相差显微镜,细胞形态

图 2 倒置相差显微镜下 HUVECs 的细胞形态（a）HUVECs P0（b）HUVECs P1（Scale bar=100μm）3.3.3 人皮肤成纤维细胞（HDFs）培养形态观察倒置相差显微镜下观察 HDFs 接种 24h 后呈长梭形、多角形贴壁伸展，胞核较大，呈卵圆形靠近胞质的中央（图 3a）；原代培养约 6 天后细胞融合至可传

相差显微镜,细胞形态

图 3 倒置相差显微镜下 HDFs 的细胞形态（a）HDFs P0（b）HDFs P1 （a：Scale bar=50μm，b：Scale bar=100μm）3.4 实验讨论

【参考文献】