重组神经生长因子NGF-DOPA的制备及其与导管材料粘附性能研究

发布时间：2020-07-09 21:52

【摘要】：外周神经损伤严重影响了肢体的功能以及病人的生活质量,目前仍然是临床的难题之一,而神经组织工程的发展为其提供了新方向。神经导管支架是神经组织工程中常用的材料,其中可生物降解的合成高分子材料,因其优良的性质,近年来成为制备神经导管支架的优良选择。但高分子材料导管一般仅能接合神经断端,并不具有促进神经再生与修复的生物特性。为了改善高分子导管材料的生物性质,近年来越来越多的研究者在神经组织工程中引入可促进神经细胞生长、髓鞘再生和轴突形成的神经生长因子。神经生长因子NGF是由神经细胞分泌的具有多种功能的营养因子,对损伤的神经具有营养、促进再生及修复的作用,因而被广泛应用于中枢与外周神经修复。而神经生长因子的半衰期短、容易失活,且易被体液稀释而降低其作用效果,因而如何将神经生长因子更有效地固定在材料表面以保持和提高其作用效果是近年来研究的热点。自然界中海洋贻贝类具有强烈的粘附性,研究者从中受到启示,发现其粘附成分主要是3,4-L-二羟基苯丙氨酸(3,4-L-dihydroxyphenylalanine,DOPA),因而以这种具有粘附能力的DOPA结构作为媒介,能将神经生长因子NGF更有效地固定于神经修复材料上,对其进行改性。本课题首先通过基因工程技术将酪氨酸重复序列基因(Tyrosine-Lysine-Tyrosine-LysineTyrosine,YKYKY)整合到NGF基因末端,利用大肠杆菌表达系统进行重组蛋白的表达,并利用Ni柱亲和层析法对目的蛋白NGF-YKYKY进行纯化,通过酪氨酸羟化反应将其中的酪氨酸转化成DOPA结构,对所获得的目的蛋白进行理化性质与生物活性的检测。将聚碳酸亚丙酯(Poly(propylene carbonate),PPC)与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)两种材料复合,通过溶液置换法,制备了不同原料比的多组神经导管支架,利用多种检测手段筛选出性能最优的一组。最后将NGF-DOPA与PPC-PLGA复合材料结合,对获得的改性神经导管材料进行一系列检测,并利用大鼠雪旺细胞对这种改性神经导管材料的生物活性进行检测。实验结果表明所构建的NGF-YKYKY基因载体可在大肠杆菌中表达,纯化和复性后经特异性鉴定确定所获得的蛋白为目的蛋白,经活性鉴定发现YKYKY和DOPA的引入并不影响NGF的功能区,它们均可诱导PC12细胞分化;我们通过溶液置换法制备了分布均一、柔韧性好可加工成导管、内部孔隙率高的PPC-PLGA复合材料膜,结果显示PPC-75PLGA复合材料膜的抗拉伸力最强,断裂伸长率最大,热力学性质最好,对细胞无毒性,有利于细胞粘附,可促进细胞增殖,因而PPC-75PLGA组复合材料膜是优良的制备神经导管支架的材料;最后我们将具有粘附性的NGF-DOPA固定在PPC-75PLGA复合膜上,通过ELISA、接触角和XPS等表征,发现与普通NGF及未经羟化的蛋白NGF-YKYKY相比,NGF-DOPA对材料的粘附能力更强,此外细胞实验结果证明,粘附于材料表面的NGF-DOPA具有良好的生物学功能,可促进雪旺细胞的粘附,调节雪旺细胞分泌一系列神经营养相关因子,为神经轴突的再生和重建提供了良好的生理环境。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08
【图文】：

第二章 重组神经生长因子的构建、表达与纯化2.3 实验结果2.3.1 黏附性神经生长因子前体 NGF-YKYKY 基因载体的构建我们将扩增的单克隆菌落送至上海生工生物公司进行序列测试，检测质粒转化结果，测序结果如下，我们将测序结果与 NGF 序列比较，结果显示该序列与 NGF 序列相符合，且其中包含 Nde I 和 Xho I 两个酶切位点，以及 C’端的 YKYKY 氨基酸序列，说明我们设计的NGF-YKYKY 基因序列（pET15b）正确，NGF-YKYKY 与 pET15b 载体的重组质粒成功转入到大肠杆菌中，且具有氨苄抗性。

2.2 重组蛋白 NGF-YKYKY 诱导表达的 SDS-PAGE 电泳分导前全菌蛋白; 2:诱导后全菌蛋白; 3: 菌体裂解后上清;4: 菌 NGF-YKYKY 的纯化亲和柱对目标蛋白质进行纯化，将溶解的菌体沉淀（其中含 Ni 柱充分结合，用洗涤缓冲液 C 和 D 洗涤，除去不与 Ni 目的蛋白NGF-YKYKY洗脱下来，将各部分样品进行15% 镍离子亲和层析法纯化后，一少部分目的蛋白因结合不牢固液 C1 流出，而最终洗脱液 E 的条带中在大约 14.4 kd 位置为 NGF-YKYKY 单体蛋白，该结果说明这种 Ni 柱亲和层析KY 纯化出来，获得的蛋白纯度高，产量大。

且具有氨苄抗性。图 2.1 重组蛋白 NGF-YKYKY 基因测序图2.3.2 重组蛋白 NGF-YKYKY 的表达我们取蛋白诱导表达前的菌体样品、诱导后的菌体样品、裂解后的上清液以及沉淀进行15% SDS-PAGE 分析。结果显示，与诱导前菌体蛋白相比，诱导后全菌蛋白在约 14.4 kd 处出现明显单一条带，1 号与 2 号泳道差异显著，这一条带所对应的分子量与 NGF 单体理论值一致，说明我们所获得的含有重组质粒的 BL21 大肠杆菌可表达目的蛋白 NGF-YKYKY，且产量较高。而比较裂解后的上清液以及沉淀的两条条带，可见菌体经超声破碎后，少量菌体蛋白以溶解的形式存在于裂解上清中，而目的蛋白主要是以单链包涵体的形式存在于沉淀中。

【参考文献】

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本文编号：2748032