基于温敏型水凝胶的载药组织工程神经构建及其修复周围神经缺损的实验研究

发布时间：2020-07-25 16:48

【摘要】：周围神经损伤是世界范围内致残的主要疾病之一。因损伤导致的神经缺损治疗手段有限,现有的方法主要是自体神经移植。但该方法存在供区神经功能受损、可移植神经来源有限等缺点,疗效也不够理想。学者们在不断寻找能够补充甚至替代自体神经移植的方法。采用人工合成的神经导管修复神经缺损是最初的一种尝试。2000年前后共11种商品化导管在美国进入临床,但因修复效果欠佳而未得到广泛应用。目前提高修复效果的方法集中在改善导管内的再生微环境,即结合材料学和工程学,制出能提供营养因子和/或细胞支持的组织工程神经(Tissue-engineered nerve grafts,TENGs)。理论上,含细胞的TENGs疗效优于仅含药物的TENGs;但因细胞移植短期内难以进入临床且不适用于急性损伤中的神经修复,载药类TENGs更具临床应用价值。近三十年来,诸多载有营养因子的TENGs被研制出来。由于这些因子生物半衰期极短,减缓其释放以延长体内作用时间成为技术重点。已有的方法是将营养因子通过各种理化方法连接于管壁或管内支架,如与导管材料混合、浸透、吸附、交联、涂层、微球包埋、添加至纳米纤维支架中等等。应用上述技术均能构建出具有药物缓释功能的TENGs,修复效果也显著优于未载药导管。但这些方法均停留在实验阶段。在已有商品化导管获批进入临床的有利基础上,载药导管的临床转化之路却并不如预期之快。众多取得良好动物实验结果的文献均未见后续的转化研究,亦无临床试验的注册。大量的实验报道与匮乏的转化成果之间的不平衡促使我们以转化医学的视角重新审视目前已有的设计思路,评估设计方案本身是否存在可能阻碍技术商品化和临床转化的因素。现有方法中,药物在制备导管时即需被溶解,与管壁材料或管内支架发生复杂的连接反应,再经干燥后备用。如进行工业化生产,在这一系列的操作中以及后续产品的贮存中,保持这些易降解蛋白质类药物的活性是一个挑战。此外,不同药物可能需要不同的连接载体,因此一种导管设计缺乏担载不同药物的灵活性。最后,能够应用于神经导管的材料本身就需满足许多严格的生物力学与生物相容性要求,进一步附于其新的载药功能使导管的制备工艺更复杂,生产成本更昂贵。这些依赖于导管结构材料的缓释方式都具有上述不利于规模化生产与商品化的因素。因此,为避免这些因素从而加快载药TENGs的临床转化,我们试图寻求一种不依赖于导管材料的药物加载与缓释方式,无需导管修饰和交联剂等连接介质,即构建出拥有独立药物缓释系统的TENGs。温敏型水凝胶是一种能满足上述要求的极具应用前景的候选材料。这种材料室温下呈液态,易与药物混合,注射至体内后在体温作用下转变为凝胶态成为药物的担载体。如应用于载药TENGs,药物的担载则可避开复杂的药物连接反应,在术中现用现溶解。目前尚未见将其作为载药系统应用于TENGs的实验研究。因此本研究构建了一种新型的TENG:神经缺损用壳聚糖导管连接后,向导管内注入与神经生长因子(nerve growth factor,NGF)混合的温敏型水凝胶溶液,在体温作用下形成凝胶,成为一种具有药物缓释功能的导管内填充物。本研究采用的水凝胶为聚氨基酸类的两亲性嵌段聚合物:聚乙二醇单甲醚-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯),mPEG-PELG。本研究包括以下几个方面:一.mPEG-PELG水凝胶的制备与检测1.制备由乙醇和L-谷氨酸经酯化反应生成γ-乙基-L-谷氨酸酯(ELG);ELG经三光气作用形成γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐(ELG-NCA);ELG-NCA以端氨基聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH_2)为大分子引发剂发生开环聚合反应生成mPEG-PELG。所测得的核磁共振氢谱(~1H-NMR)上各信号峰均能够准确归属,表明成功制备了目标聚合物。2.微观结构检测利用红外光谱、荧光光谱法和透射电子显微镜检测聚合物,发现其二级结构中以β折叠为主且能出现胶束化行为,具有发生凝胶转变的微观结构基础。3.溶胶-凝胶转变采用试管倒置法和流变仪检测聚合物的凝胶转变行为。mPEG-PELG溶液均可随温度升高而发生凝胶转变,且随着浓度升高,发生转变的温度逐渐下降。混有NGF的8.0 wt%的聚合物可在体温附近发生凝胶转变,被选作体内实验的聚合物浓度。4.体外降解与细胞毒性与在Tris-HCl缓冲溶液中相比,水凝胶在含弹性蛋白酶或蛋白酶K的Tris-HCl缓冲溶液中降解加快,但仍持续存在26天以上。对大鼠施旺细胞系RSC96细胞进行MTT实验未见聚合物具有细胞毒性。二.mPEG-PELG担载NGF的体外释放实验1.担载NGF的剂量优化及体外释放曲线配置NGF浓度为0.5、1.0和1.5 ng/μL的水凝胶,测试缓释曲线。根据NGF在1~10 ng/mL时对轴突生长促进作用最佳,选择1.0 ng/μL的剂量。第1天释放浓度为13.87 ng/mL,第2天降至10 ng/mL以下,随后每日缓释浓度平稳在1.5 ng/mL左右,持续28天。2.缓释NGF的生物活性载有NGF的mPEG-PELG水凝胶的缓释上清能诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞分化,随后对PC12细胞进行Western blot检测发现NGF下游的MAPK/ERK通路被激活。表明释放出的NGF有生物学活性。三.基于mPEG-PELG构建的担载NGF组织工程神经的体内实验1.TENG构建与实验分组将mPEG-PELG作为可注射性的药物载体构建TENG:神经缺损用壳聚糖导管连接后,向导管内注入混有NGF的mPEG-PELG溶液,10 min后形成凝胶成为一种载药的管内填充物。为评估疗效,制备大鼠坐骨神经10 mm缺损模型并进行如下分组:Scaffold组:缺损由导管连接;Scaffold+mPEG-PELG组:导管内注射不含NGF的mPEG-PELG;Scaffold+NGF/IM组:缺损由导管连接后,每日接受2.0μg/kg NGF肌注;Scaffold+NGF/mPEG-PELG组:新型载药TENG组;Autograft组:自体神经移植。2.再生神经纤维的组织形态学术后14天取术侧神经进行纵切或横切,免疫荧光标记神经丝蛋白(NF200),纵切片上测得Scaffold+NGF/mPEG-PELG组再生神经纤维长度为7231.67±216.94μm,较Scaffold组,Scaffold+mPEG-PELG组,Scaffold+NGF/IM组显著增加,与Autograft组(8123.34±262.32μm)无统计学差异。横切片上计数再生神经纤维数量,组间比较呈现类似的结果。术后3个月在距导管远端3 mm处横切,标记NF200和S100β(施旺细胞标志物),观察远端吻合口的神经再生。Scaffold+NGF/mPEG-PELG组和Autograft组轴突数量和S100β染色阳性的神经纤维数量均显著多于其他三组。3.再生神经纤维髓鞘形成情况术后3个月在距导管远端3 mm处进行横切,电镜下测量髓鞘层数、髓鞘厚度、有髓神经纤维的直径、密度以及百分比。在这五个指标上,Scaffold+NGF/mPEG-PELG组与Autograft组效果相近,均显著高于其他三组。4.电生理功能术后3个月时,Scaffold+NGF/mPEG-PELG组和Autograft组复合肌肉动作电位的波幅大于其他三组,运动神经传导速度快于其他三组,均具有统计学差异。5.终末靶器官与运动功能术后21天时各组的腓肠肌和胫骨前肌均出现明显萎缩且运动终板的失神经支配现象明显,组间无明显差异。术后6个月时各组均有所改善。Scaffold+NGF/mPEG-PELG组实验侧/正常侧的肌肉湿重比恢复至腓肠肌0.54±0.02,胫骨前肌0.85±0.03,出现神经支配的运动终板比例为31.67±3.28%,3项数据的比较均显著优于Scaffold组、Scaffold+mPEG-PELG组和Scaffold+NGF/IM组,与自体神经移植组接近。术后9个月行足迹分析,Scaffold+NGF/mPEG-PELG组和Autograft组坐骨神经功能指数(-32.67±3.58、-28.84±4.16)显著高于Scaffold组(-64.84±6.16)、Scaffold+mPEG-PELG组(-62.07±5.58)、和Scaffold+NGF/IM组(-51.67±4.20)。结论:本研究作为前期基础研究,为构建利于规模化生产、具有临床转化潜力、且操作简便应用灵活的载药TENGs提供了新的思路。mPEG-PELG温敏型水凝胶可作为NGF的缓释载体有效延长其释放周期;应用mPEG-PELG构建的TENG在桥接大鼠坐骨神经10 mm缺损中取得了良好的修复效果,再生神经的形态学与功能学恢复接近自体神经移植。其构建方式具有转化优势:药物缓释系统与导管材料的分离简化了制造工艺,无需修饰导管,无需复杂的药物连接反应,药物可现用现溶解避免药效损失;温敏型水凝胶的可注射性便于操作;可灵活更换担载药物。基于温敏型水凝胶构建的载药TENGs有潜力成为商品化产品,有助于填补临床上对有效修复神经缺损且无副损伤方法的需求。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R688;R318.08
【图文】：

导管治疗,人工神经,策略

每年用于周围神经修复的产品市场价值约为 15 亿美元，而全球周经损伤的治疗产品市场价值更是高达 35 亿美元，并以每年 11%的速度增长在科研领域，对人工神经移植物的研究投入同样在加大，全力寻找进提高人工导管疗效的方法（图 1.1）[10]。最初的研究方向是对导管结构进行改研究人员认为疗效欠佳的一个重要原因是，这类产品完全中空的结构没有给再生神经提供足够的物理支持，因此尝试研制了各种管内的纤维状、柱填充支架，期望有助于施旺细胞的排列迁移与再生轴突的生长延伸。与中结构相比，在实验中表现出一些优势[10,16]。而目前的研究方向则更多地集为再生神经提供营养因子支持或细胞支持，通过改善损伤局部微环境以利经再生，即结合材料科学和组织工程学，制备出能够提供神经营养因子和（细胞支持的组织工程神经（Tissue-engineered nerve grafts，TENGs）[11,12,17-19且已经在动物实验中取得了鼓舞人心的治疗效果[20-26]，成为目前修复神经缺最具吸引力的研究领域。

浸透法,梯度,交联法

图 1.2 应用直接浸透法构建梯度载药神经导管[57].1.2 与管壁材料交联法在该方法中，管壁材料通过与欲担载药物发生化学交联反应而产生4,42,58-63]。不同于上述直接浸透法，交联法需要靠交联剂作为中间桥梁将药物间接相连。体外实验在评估神经导管通过交联法担载药物的缓释情况时，发现药放周期可以达到一个月甚至两个月，而浸透法的释放时长多为数天或数项体外研究中用碳化二亚胺（carbodiimide）作为交联剂，将 NGF 加载-磷酸三钙膜（GTG）上[62]。如图 1.3 所示，carbodiimide 一侧可与 NGF 共价结合，另一侧与 GTG 膜表面的羧基共价结合。

交联法,药物,管壁,材料

图 1.2 应用直接浸透法构建梯度载药神经导管[57].1.2 与管壁材料交联法在该方法中，管壁材料通过与欲担载药物发生化学交联反应而产生4,42,58-63]。不同于上述直接浸透法，交联法需要靠交联剂作为中间桥梁将物间接相连。体外实验在评估神经导管通过交联法担载药物的缓释情况时，发现药周期可以达到一个月甚至两个月，而浸透法的释放时长多为数天或数体外研究中用碳化二亚胺（carbodiimide）作为交联剂，将 NGF 加载磷酸三钙膜（GTG）上[62]。如图 1.3 所示，carbodiimide 一侧可与 NGF 价结合，另一侧与 GTG 膜表面的羧基共价结合。

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