界面局域电刺激对前成骨细胞分化影响及其机制的研究
发布时间：2020-07-26 23:27
【摘要】：电刺激是一种有效调制细胞和组织(包括骨组织)生长行为的手段,如在植入体表面构建具有电刺激功能的生物活性涂层,则对植入体建立长期、有效地调制细胞生长/组织重建行为和抗菌效能具有重要的意义。本文以构建电刺激功能性涂层为远期目标,采用平面微电极,通过强作用于表面附着细胞的界面局域电刺激模式,并以电极作用于细胞的源头为切入点,系统地开展了界面局域电刺激模式对骨细胞成骨分化影响和作用机制的研究。主要研究内容和结果如下:1、电刺激细胞装置构建分别采用粘触式和压触式,研究了电刺激细胞培养装置中导线及电极连接方式的可重复性和细胞安全性。通过“银浆/环氧树脂”的封触式方式,将铜导线与平面微电极相连接。结果表明:在较高电压刺激时(1-1.5V),在电极表面有铜元素存在,说明铜线会被电化学腐蚀。而此过程也使得蛋白在电极正、负极和中间区域上吸附效果差异明显。同时在较长时间置于培养基中刺激时,封触点会脱落。采用压触式方式,设计了聚四氟乙烯电刺激细胞培养盒,将化学稳定的铂(Pt)导线牢固地固定于电极表面,并将导线置于模具内部,有效地防止导线产生电化学腐蚀现象。其电刺激细胞培养盒能可靠地保障电刺激细胞实验的开展。2、适合界面局域电刺激的平面微电极制备电极对外作用强度取决于电极表面的注入电荷量(Qinj),而其与电极材料电荷注入容量(CQ)的特性密切相关,即电极CQ越高,在相同施加电压下其Qinj也越大。对金(Au)、氧化锡铟(ITO)和聚吡咯(Ppy)三种平面微电极表面的注入电荷容量测定表明,Ppy分别是Au和ITO的24和12倍,Ppy电极显示出适合作为产生界面局域电刺激模式的电极。在电致聚合方法制备Ppy平面微电极中,通过调节沉积电流密度,改变Ppy聚合/沉积动力学过程,实现对Ppy电极特性调控。实验结果表明:随着沉积电流密度的增大(3、5和8mA/cm2),Ppy聚合/沉积过程增强,Ppy厚度分别为20、50和80 nm。电化学测定显示其厚度变化可改变Ppy电极的注入电荷能力(CQ),CQ随厚度增加而增大。细胞培养实验表明Ppy电极具有良好的生物相容性。因此,合理地选择Ppy沉积条件,可优化电极表面对外作用能力,进一步强化界面局域电刺激的潜能。3、界面局域电刺激对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响Ppy平面微电极对在表面附着的前成骨细胞(MC3T3-E1)作用结果显示:在电极上只需施加1 mV就可以有效促进细胞成骨分化,而ITO电极则需施加250 mV,说明本研究的Ppy电极对细胞可以很好地发挥界面局域电刺激模式。综合不同CQ的Ppy电极对细胞作用结果,发现其电极刺激强度Qinj对MC3T3-E1细胞成骨分化影响行为呈抛物线特征,不同Ppy电极均在Qinj为0.08-0.15 μC时呈现显著增强细胞成骨分化效能;高CQ的Ppy电极(Ppy-III),施加1 mV,Qinj就可达0.08 μC。揭示了界面局域电刺激对细胞的作用程度不直接依赖于施加的电压,而以材料特性相关的电极Qinj为关键参量。此外,刺激强度脉冲频率上,1或25 Hz的电刺激时显示可产生增强细胞成骨分化作用,而50 Hz的刺激则没有显示其效能;在刺激时间上,每天刺激时间为0.5、1和24 h/d时,1h/d刺激细胞可明显上调细胞的ALP蛋白和成骨相关基因的表达;而在刺激时机上,发现界面局域电刺激引发的成骨分化潜能与细胞生长阶段有关,在8 d细胞培养的早期(第2-5 d)进行的电刺激对于促进成骨分化的促进作用比对后期(第6-8 d)强。4、界面局域电刺激机理分析细胞膜电压门控被认为是电刺激细胞作用关键点,依据其种类和特性,结合本实验中电极电场分布特点,以及电刺激强度Qinj与细胞成骨分化响应的关系,揭示了界面局域电刺激机理特征为:电极Qinj产生的电场主要作用于界面处的细胞膜,且电场方向平行于细胞膜,强化胞内外离子迁移差异性,从而在很低电压下即可有效改变膜电位,开启细胞膜的L-型电压门控钙离子通道,激活细胞成骨分化通路。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318
【图文】：
场传输电信号／脉冲［３］。报道指出，体内内源性电场可通过离子物质和大分子的运逡逑输、膜电压和细胞分裂轴以控制器官不对称来调节生物学过程［４】。逡逑图１．１给出了生物体内四个层次上存在的生物电，分别为细胞器水平的核膜逡逑在细胞膜上的电位；细胞水平上细胞膜电位维持膜中离子通道和泵的功能；组织逡逑水平上形成俎织的细胞驱动跨上皮电位，从而产生电场；在器官水平上局部和长逡逑程特性的组合导致整个解剖学轴线上的梯度。逡逑Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ邋ｌｅｖｅｌ逦Ｂ邋Ｃｅｌｌ邋ｌｅｖｅｌ逡逑Ｎｕｃｌｅａｒ邋ｅｎｖｅｌｏｐｅ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ逦Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ逡逑Ｎｕｃｌｅａｒ逡逑暴邋！邋＃逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ逡逑ｆｉｌａｍｅｎｔｓ逡逑Ｃ＊邋Ｔｉｓｓｕｅ邋ｌｅｖｅｌ逦Ｊ）邋Ｏｒｇａｎｉｓｍ邋ｌｅｖｅｌ逡逑Ｗｏｕｎｄ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：邋ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ逦Ｗｈｏｌｅ邋ａｎｉｍａｌ邋（ｏｒ邋ａｐｐｅｎｄａｇｅ）：邋ｍａｊｏｒ邋ｂｏｄｙ邋ａｘｅｓ逡逑ｗ逦ｋ邋Ｔｔｇｈｔ邋（ｕｎｃｔｔｏｏｆ逡逑－＂＾ｗ邋．：邋－逡逑图１．１内源性生物电特性。（Ａ）细胞器水平（如核膜）在细胞膜上的电位。（Ｂ）细胞膜电逡逑位维持膜中离子通道和泵的功能。（Ｃ）形成组织的细胞驱动跨上皮电位
称为三螺旋［９］。肢原纤维主要表现为剪切压电材料，并且在其轴向方向上具有单逡逑轴极化作用［４］。逡逑图１．４邋Ａ显示了单根胶原纤维（直径６５邋ｒａｎ）在金涂覆的硅（Ｓｉ）基板上的逡逑原子力显微镜（ＡＦＭ）图像的高分辨率横向压电力显微镜（ＰＦＭ）图像（图１．４逡逑３逡逑
尖端和样品下方的基板之间的ＡＣ偏压施加电场穿过样品，导致压电材料变形。逡逑接触的ＡＦＭ尖端检测到变形，随后转换为压电响应的振幅。在横向模式下，ＡＦＭ逡逑尖端的扭转表现出畴的剪切变形。较小的扫描尺寸图像如图１．４邋Ｃ和图１．４邋Ｄ所逡逑示。横向ＰＦＭ图像清楚地区分了胶原纤维与基底背景，表明在肢原纤维中存在逡逑剪切压电响应。此外，存在对于胶原纤维内的重叠和间隙区域的周期性改变相关逡逑的压电响应振幅的周期性调制。测量到具有较大压电响应幅度（在图像中具有较逡逑亮对比度）的区域为３０邋ｎｍ宽（对应于重叠区域）和其他具有较小振幅４０邋ｎｍ邋（对逡逑应于间隙区域）的区域［１（）］。胶原纤维沿纤维轴的横向压电响应和可忽略的垂直和逡逑径向压电响应，说明沿胶原纤维轴的单向极化。逡逑＝｜ＱＢ逡逑图１．４高分辨率压电力显微镜图像显示单个胶原纤维中的压电不均R浴＃ǎ粒┰诮鹜扛驳腻义希樱楸砻嫔舷允局本段叮靛澹睿淼慕涸宋男蚊餐枷瘢唬ǎ拢校疲脱沟缦煊φ穹枷瘢允炯溴义舷逗椭氐蛑醒沟缦煊Φ谋浠唬煤停囊越闲〉纳璩叽缁竦玫南嘤π蚊埠停校疲头
本文编号：2771439
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318
【图文】：
场传输电信号／脉冲［３］。报道指出，体内内源性电场可通过离子物质和大分子的运逡逑输、膜电压和细胞分裂轴以控制器官不对称来调节生物学过程［４】。逡逑图１．１给出了生物体内四个层次上存在的生物电，分别为细胞器水平的核膜逡逑在细胞膜上的电位；细胞水平上细胞膜电位维持膜中离子通道和泵的功能；组织逡逑水平上形成俎织的细胞驱动跨上皮电位，从而产生电场；在器官水平上局部和长逡逑程特性的组合导致整个解剖学轴线上的梯度。逡逑Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ邋ｌｅｖｅｌ逦Ｂ邋Ｃｅｌｌ邋ｌｅｖｅｌ逡逑Ｎｕｃｌｅａｒ邋ｅｎｖｅｌｏｐｅ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ逦Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ逡逑Ｎｕｃｌｅａｒ逡逑暴邋！邋＃逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ逡逑ｆｉｌａｍｅｎｔｓ逡逑Ｃ＊邋Ｔｉｓｓｕｅ邋ｌｅｖｅｌ逦Ｊ）邋Ｏｒｇａｎｉｓｍ邋ｌｅｖｅｌ逡逑Ｗｏｕｎｄ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：邋ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ逦Ｗｈｏｌｅ邋ａｎｉｍａｌ邋（ｏｒ邋ａｐｐｅｎｄａｇｅ）：邋ｍａｊｏｒ邋ｂｏｄｙ邋ａｘｅｓ逡逑ｗ逦ｋ邋Ｔｔｇｈｔ邋（ｕｎｃｔｔｏｏｆ逡逑－＂＾ｗ邋．：邋－逡逑图１．１内源性生物电特性。（Ａ）细胞器水平（如核膜）在细胞膜上的电位。（Ｂ）细胞膜电逡逑位维持膜中离子通道和泵的功能。（Ｃ）形成组织的细胞驱动跨上皮电位
称为三螺旋［９］。肢原纤维主要表现为剪切压电材料，并且在其轴向方向上具有单逡逑轴极化作用［４］。逡逑图１．４邋Ａ显示了单根胶原纤维（直径６５邋ｒａｎ）在金涂覆的硅（Ｓｉ）基板上的逡逑原子力显微镜（ＡＦＭ）图像的高分辨率横向压电力显微镜（ＰＦＭ）图像（图１．４逡逑３逡逑
尖端和样品下方的基板之间的ＡＣ偏压施加电场穿过样品，导致压电材料变形。逡逑接触的ＡＦＭ尖端检测到变形，随后转换为压电响应的振幅。在横向模式下，ＡＦＭ逡逑尖端的扭转表现出畴的剪切变形。较小的扫描尺寸图像如图１．４邋Ｃ和图１．４邋Ｄ所逡逑示。横向ＰＦＭ图像清楚地区分了胶原纤维与基底背景，表明在肢原纤维中存在逡逑剪切压电响应。此外，存在对于胶原纤维内的重叠和间隙区域的周期性改变相关逡逑的压电响应振幅的周期性调制。测量到具有较大压电响应幅度（在图像中具有较逡逑亮对比度）的区域为３０邋ｎｍ宽（对应于重叠区域）和其他具有较小振幅４０邋ｎｍ邋（对逡逑应于间隙区域）的区域［１（）］。胶原纤维沿纤维轴的横向压电响应和可忽略的垂直和逡逑径向压电响应，说明沿胶原纤维轴的单向极化。逡逑＝｜ＱＢ逡逑图１．４高分辨率压电力显微镜图像显示单个胶原纤维中的压电不均R浴＃ǎ粒┰诮鹜扛驳腻义希樱楸砻嫔舷允局本段叮靛澹睿淼慕涸宋男蚊餐枷瘢唬ǎ拢校疲脱沟缦煊φ穹枷瘢允炯溴义舷逗椭氐蛑醒沟缦煊Φ谋浠唬煤停囊越闲〉纳璩叽缁竦玫南嘤π蚊埠停校疲头
本文编号：2771439
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